周艷華 李 濤 潘小紅 向 俊

(1. 長沙環(huán)境保護職業(yè)技術學院，湖南 長沙 410111；2. 湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院食品安全監(jiān)測與預警湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410111；3. 湖南省藥品檢驗研究院，湖南 長沙 410001)

牛奶中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，是一種優(yōu)質(zhì)食品來源。隨著生活水平的提高，乳制品受到人們青睞，乳品安全也受到社會廣泛關注，而原料乳安全直接影響乳制品安全。喹諾酮藥物是一種人工合成抗菌藥物，具有抗菌譜廣和價格低廉等特點，被廣泛應用于動物疾病的預防和治療[1-2]。藥物濫用，會出現(xiàn)動物的毒性反應，且此類藥物半衰期長，殘留的喹諾酮藥物會造成過敏，可能對人體造成肝腎功能損傷和神經(jīng)中毒等不良反應[3-4]。歐美發(fā)達國家制定了多種喹諾酮類藥物在動物組織中的最高殘留量[5]。為加強獸藥殘留監(jiān)控工作，保證動物性食品衛(wèi)生安全，中國也修訂了《動物性食品中獸藥最高殘留限量》[6]。

目前，喹諾酮藥物殘留的測定方法主要有高效液相色譜法[7-8]、酶聯(lián)免疫法[9]、液相串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11]等。液相色譜法靈敏度低，檢測項目少，選擇性差；ELISA法儀器化程度低、前處理簡單，適用于現(xiàn)場大批量樣品快速篩查，但靈敏度和準確度有待提高。液質(zhì)聯(lián)用法具有靈敏度高、選擇好、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，是藥物殘留定量定性分析的首選方法。國家現(xiàn)有標準中檢測動物源性食品中喹諾酮類化合物的標準有GB/T 20366—2006和GB/T 21312—2007。GB/T 21312—2007采用緩沖溶液提取和HLB固相萃取柱凈化，前處理步驟繁雜，而GB/T 20366—2006未對牛奶基質(zhì)進行驗證研究，不適用于原料奶檢測。目前報道的原料乳中多種喹諾酮藥物殘留凈化方法包括HLB固相萃取柱法[12]、免疫固相萃取柱法[13]、QuEChERS法[14]等，其均通過液質(zhì)聯(lián)用儀進行檢測。

試驗擬采用液液萃取凈化法進行前處理，并將該前處理技術與超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合，用于大批量原料乳中18種喹諾酮類藥物殘留的快速檢測，旨在為有效監(jiān)控原料乳中喹諾酮藥物提供依據(jù)，從而保證乳制品安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳：市售；

C18色譜柱：150 mm×2.1 mm，3 μm，美國賽默飛世爾公司；

乙腈、甲醇、乙酸乙酯：色譜純，德國默克公司；

甲酸：優(yōu)級純，上海安譜實驗科技股份有限公司；

恩諾沙星(CAS 93106-60-6，≥98%)、環(huán)丙沙星(CAS 85721-33-1，≥99.4%)、氧氟沙星(CAS 82419-36-1，≥99.7%)、諾氟沙星(CAS 70458-96-7，≥98%)、培氟沙星(CAS 70458-92-3，≥99.8%)、洛美沙星(CAS 98079-52-8，≥98%)、達氟沙星(CAS 112398-08-0，99.9%)、依諾沙星(CAS 74011-58-8，99.9%)、沙拉沙星(CAS 91296-87-6，97.7%)、雙氟沙星(CAS 91296-86-5，96.2%)、司帕沙星(CAS 110871-86-8，99.9%)、吡哌酸(CAS 51940-44-4，98.0%)、西諾沙星(CAS 28657-80-9，98.0%)、萘啶酸(CAS 389-08-2，99.9%)、氟甲喹(CAS 42835-25-6，99.6%)、氟羅沙星(CAS 79660-72-3，99.2%)、奧比沙星(CAS 113617-63-3，97.1%)、麻保沙星(CAS 115550-35-1，99.9%)標準品：北京壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜：TSQ Quantis型，美國賽默飛世爾公司；

電子分析天平：BSA224s型，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；

高速離心機：TG16-WS型，長沙市湘儀儀器有限公司；

超聲波清洗器：2050T型，上海安譜實驗科技股份有限公司；

高速振蕩器：CM-1000型，東京理化器械株式會社。

1.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在HESI離子源下，采用Full掃描和SRM掃描，毛細管電壓3 500 V；汽化溫度350 ℃；鞘氣壓0.24 kPa；輔助氣壓0.091 kPa；取標準溶液直接進質(zhì)譜，通過Full掃描，確定電離模式和母離子m/z，通過SRM掃描，確認最優(yōu)質(zhì)譜條件。

1.4 液相色譜條件優(yōu)化

在相同其他色譜條件下，優(yōu)化流動相種類，優(yōu)化的無機流動相為：5 mmol/L乙酸銨溶液、體積分數(shù)0.1%甲酸溶液、體積分數(shù)0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸銨溶液，優(yōu)化的有機流動相為：甲醇和乙腈，考察樣品的分離效果與響應度。設定無機流動相為A相，有機流動相為B相；流速0.3 mL/min；色譜柱溫35 ℃；進樣體積5 μL。梯度洗脫程序：0.0～0.5 min，90% A；0.5～3.0 min，90%～70% A；3.0～7.5 min，70%～10% A；7.5～9.5 min，10% A；9.5～9.6 min，10%～90% A；9.6～12.5 min，90% A。

1.5 樣品前處理工藝優(yōu)化

精密稱取混合均勻的原料乳2.0 g于50 mL離心管中(n=6)，加入3 mL 1#提取劑(分別為水、0.1%甲酸及0.2%甲酸)，振搖5 min，超聲10 min，加入15 mL 2#提取劑(分別為甲醇、乙腈和乙酸乙酯)，振蕩15 min，離心，取5.0 mL上清液氮吹至近干，15%甲醇水溶液定容至1.0 mL，過0.22 μm有機濾膜，測定并計算喹諾酮類化合物的回收率，確定最優(yōu)提取溶劑。

1.6 方法學驗證

取空白原料乳，配制質(zhì)量濃度為2.0～100.0 ng/mL的基質(zhì)標準線性系列溶液，制作標準曲線。在空白原料乳中添加低濃度混合標準溶液，按最優(yōu)的前處理工藝處理后測定，S/N≥3的濃度為檢出限(LOD)，S/N≥10的濃度為定量限(LOQ)。分別在原料乳中加入18種喹諾酮類混合標準溶液，加標后樣品濃度分別為2.0，4.0，20.0 μg/kg(n=6)。測定18種喹諾酮藥物殘留含量，計算回收率和相對標準偏差值。

1.7 基質(zhì)效應評價

取空白原料乳基質(zhì)，配制空白基質(zhì)混合標準系列溶液，同時配制相同濃度的溶劑標準系列溶液，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀測定后得基質(zhì)標準曲線和溶劑標準曲線。依據(jù)基質(zhì)效應(ME)可由基質(zhì)標準曲線斜率與溶劑標準曲線斜率百分比表示的方法反映每個喹諾酮化合物的基質(zhì)效應[15-16]。

1.8 樣品檢測

取20批次原料乳，用所建立的檢測方法檢測樣品中18種喹諾酮類化合物，判定樣品中是否有喹諾酮藥物殘留。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，分析準確度、精密度、檢出限、定量限及回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

經(jīng)Full掃描得知，18種喹諾酮類化合物在正離子模式下響應值最高，通過SRM掃描，得到喹諾酮化合物母離子、子離子及相應最佳碰撞電壓、RF-lens電壓，選擇信號強度最高的子離子為定量離子。18種喹諾酮類化合物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 18種喹諾酮類化合物的質(zhì)譜參數(shù)表?

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

在最優(yōu)質(zhì)譜、色譜條件下，18種喹諾酮化合物的定量離子提取色譜圖見圖1。由圖1可知，18種喹諾酮在12.5 min 內(nèi)得到了有效分離。當無機流動相分別為5 mmol/L 乙酸銨溶液、體積分數(shù)0.1%甲酸溶液、體積分數(shù)0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸銨溶液時，有機流動相為甲醇、乙腈、體積分數(shù)0.1%甲酸—乙腈均能分離出18種喹諾酮類化合物，但存在峰形、分離度及響應度的差異。當無機流動相為體積分數(shù)0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸銨溶液時，喹諾酮化合物的分離度及峰形較好，有機流動相為乙腈時，化合物分離效果及響應值最高。由于所測喹諾酮化合物種類較多，低濃度的乙酸銨溶液可改善喹諾酮化合物的峰形，使峰型更尖銳，分離度更好，低濃度甲酸可為喹諾酮化合物電離時提供質(zhì)子。有機流動相為甲醇時，組分色譜峰形易變寬，組分分離度低，而乙腈作為有機流動相時可明顯改善酸喹諾酮化合物的峰形，因此最佳的色譜條件為體積分數(shù)0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸銨—乙腈。

圖1 18種喹諾酮類混合標準溶液定量離子色譜圖

2.3 1#提取劑優(yōu)化結(jié)果

由圖2可知，3種1#提取劑中，15種喹諾酮化合物的回收率存在差異，萘啶酸、吡哌酸、氟甲喹3種化合物的回收率無顯著差異，其他化合物經(jīng)水提取后回收率最高，為75%～110%，0.2%甲酸水溶液的最低。1#提取劑主要將待測物中目標化合物溶解分散，通過超聲波輔助提取，利用超聲波的空化作用提高樣品中的喹諾酮化合物的運動速率和穿透力，從而提高回收率。加入甲酸后，降低了提取溶液的pH值，使原料乳中蛋白質(zhì)凝聚，吸附了喹諾酮，從而影響了回收率。試驗不采用常用的獸藥殘留緩沖液提取液如Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液和磷酸鹽緩沖溶液，因液液萃取凈化法會將難揮發(fā)的鈉鹽帶入質(zhì)譜，影響質(zhì)譜的靈敏度，因此選擇最優(yōu)的1#提取劑為水。

圖2 1#提取劑對喹諾酮回收率的影響

2.4 2#提取劑優(yōu)化結(jié)果

由圖3可知，選擇水作為1#提取劑，3種2#提取劑中，乙腈提取后喹諾酮化合物回收率最高，乙酸乙酯提取后目標化合物回收率最低，2#提取劑對吡哌酸、萘啶酸、氟甲喹3種化合物的回收率影響不顯著。獸藥殘留最常用的提取劑包括甲醇、乙腈和乙酸乙酯，三者中乙腈極性最大，乙酸乙酯極性最小，喹諾酮化合物為酸堿兩性化合物，易溶于水，經(jīng)1#超聲提取后，喹諾酮化合物已分散在水性介質(zhì)中，因此乙酸乙酯提取回收率低，甲醇提取時水溶性蛋白進入提取液中，影響了目標化合物的電離，回收率不高。乙腈具有沉淀蛋白作用，經(jīng)乙腈提取后溶液中的蛋白質(zhì)、脂肪含量大大降低，基質(zhì)干擾減少，從而提高了回收率。

圖3 2#吸附劑對喹諾酮回收率的影響

2.5 線性關系、檢出限和定量限結(jié)果

由表2可知，當質(zhì)量濃度為2.0～100.0 ng/mL時，18種喹諾酮化合物的線性關系良好(R2≥0.992)，檢出限(LOD)為0.02～0.50 μg/kg，定量限(LOQ)為0.06～1.50 μg/kg，此方法所得大部分喹諾酮化合物的檢出限和定量限優(yōu)于GB/T 20366—2006和 GB/T 21312—2007的。不同喹諾酮化合物的分子量和結(jié)構(gòu)不同，在同一條件下的響應度和信噪比不同，因此檢出限和定量限也不同。

表2 喹諾酮化合物的標準曲線方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限

2.6 準確度和精密度結(jié)果

由表3可知，當喹諾酮加標濃度為2.0 μg/kg時，回收率為74.0%～100.6%，相對標準偏差RSD為2.0%～12.5%；當喹諾酮加標濃度為4.0 μg/kg時，回收率為76.7%～100.0%，相對標準偏差RSD為1.8%～13.0%；當喹諾酮加標濃度為20.0 μg/kg時，回收率為80.0%～106.5%，相對標準偏差RSD為1.1%～10.2%。3個梯度加標回收率和精密度良好，回收率符合GB/T 27404—2008中當加標濃度<0.1 mg/kg時，回收率為60%～120%的要求。因18種喹諾酮化合物的定量限不同，為使準確度試驗覆蓋所有喹諾酮化合物，采用濃度較高的依諾沙星的定量限為最低加標濃度，分別以定量限、2倍定量限和10倍定量限濃度進行加標試驗，結(jié)果表明試驗建立的方法滿足原料乳中18種喹諾酮化合物的測定。

表3 喹諾酮化合物的回收率和精密度

2.7 基質(zhì)效應評價

由圖4可知，吡哌酸和西諾沙星表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應，其他喹諾酮化合物的基質(zhì)效應均在80%～120%，表現(xiàn)為基質(zhì)效應不明顯。該方法中有兩種化合物的基質(zhì)效應明顯，為保證所有化合物檢測結(jié)果的準確性，仍采用基質(zhì)標準曲線，非測定吡哌酸和西諾沙星，可以選用溶劑標準曲線。因液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀的離子源結(jié)構(gòu)特點，不可避免地會出現(xiàn)基質(zhì)效應，并對目標化合物的靈敏度、準確度和方法的重現(xiàn)性等產(chǎn)生影響。通常采用不同凈化工藝、同位素內(nèi)標及基質(zhì)標準曲線來減少基質(zhì)效應，試驗采用液液萃取法凈化了原料乳中的蛋白質(zhì)、脂肪基質(zhì)，且結(jié)果表明此研究方法中大部分喹諾酮類化合物基質(zhì)效應不明顯，說明前處理工藝能夠最大限度地凈化基質(zhì)，保證檢驗結(jié)果的準確性。

圖4 18種喹諾酮化合物的基質(zhì)效應

2.8 方法運用

為驗證方法的有效性，采用所建立的方法對市售的20批原料乳進行檢測，樣品中均未檢出上述18種喹諾酮類化合物，且質(zhì)控樣品加標回收率符合GB/T 27404—2008要求，表明結(jié)果準確可靠。說明原料乳中喹諾酮化合物殘留風險較小，后續(xù)將選擇不同來源的原料奶進行檢測。

3 結(jié)論

建立了同時快速檢測原料乳中18種喹諾酮類藥物殘留的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。采用液液萃取法提取凈化樣品，并對線性方程、檢出限、定量限、回收率等方法學指標進行了驗證。結(jié)果表明，與國家標準相比，此研究驗證了原料乳中喹諾酮化合物的檢測方法，增加了所檢測目標化合物的數(shù)量，定量限優(yōu)于國家標準，在不影響準確度的情況下采用液液萃取工藝，大大縮短了檢驗時間，提高了檢驗效率，降低了成本，提高了檢測通量，且基質(zhì)效應不明顯。該方法作為批量快速檢測原料乳中18種喹諾酮類化合物定量檢測方法，具有簡單高效、靈敏度高等優(yōu)點。