易守福 梁 鋒 何青科 宋 陽 廖燕芝

(1. 湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙 410017；2. 食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410017)

黑茶中含有500多種化合物，富含蛋白質(zhì)、維生素和氨基酸等，具有極高的營養(yǎng)價值，長期飲用還具有很好的減肥、降血脂效果[1]。黑茶因其保健功能和獨特品質(zhì)，深受廣大消費者喜愛。然而黑茶的采茶周期長，春、夏、秋三季均可采摘新鮮茶葉，茶葉在大面積種植過程中，為保障茶葉品相、防蟲除草，增加了除草劑等農(nóng)藥的使用幾率和農(nóng)藥殘留的風(fēng)險。黑茶是湖南省主要的茶葉品種，其中安化黑茶又為國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，其產(chǎn)品質(zhì)量對黑茶的國內(nèi)外市場具有重要影響。酰胺類除草劑是一類高效、高選擇性的觸殺性農(nóng)藥，具有廣譜、高效和施用方便等特點[2-3]。然而此類農(nóng)藥過量使用后易在地表水和土壤中殘留[4]，進(jìn)而通過食物鏈對人體健康造成危害。美國環(huán)保局已將甲草胺、乙草胺、丁草胺等用量較大的酰胺類除草劑列為對人類可能致癌的物質(zhì)[5]。歐盟國家制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定茶葉中酰胺類農(nóng)藥的最大殘留限量為0.05～0.10 mg/kg，而中國食品安全標(biāo)準(zhǔn)暫未對茶葉中酰胺類除草劑的限量作出規(guī)定，限制了中國茶葉的出口貿(mào)易。

目前對于酰胺類除草劑殘留量的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[6]、高效液相色譜—質(zhì)譜法(HPLC-MS)[7]、高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[8-10]、氣質(zhì)聯(lián)用色譜法(GC-MS)[3,11]及氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[12]。由于黑茶基質(zhì)較復(fù)雜，在質(zhì)譜檢測分析時可能帶來基體效應(yīng)和基質(zhì)干擾的影響，故在進(jìn)行質(zhì)譜分析前，采取適當(dāng)?shù)那疤幚矸椒ㄓ葹橹匾?。目前酰胺類除草劑的前處理方法主要有加速溶劑萃?ASE)[13]、固相萃取(SPE)法[14-15]和QuECHERS法[10-11,16]，傳統(tǒng)的前處理方法存在操作繁瑣，有機(jī)溶劑用量大，價格昂貴等缺點。QuEChERS方法具有操作簡便快速、凈化效果好、有機(jī)溶劑消耗少、環(huán)境友好等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于基質(zhì)復(fù)雜的樣品中農(nóng)藥殘留的檢測[17]。

研究擬采用QuEChERS前處理凈化，結(jié)合GC-MS/MS檢測技術(shù)，以建立快速、高效、準(zhǔn)確的同時測定黑茶中10種酰胺類除草劑殘留的檢測方法，為不同茶葉品種中酰胺類除草劑殘留的檢測提供參考，同時也為茶葉中酰胺類除草劑的監(jiān)測監(jiān)管提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

湖南安化黑茶、廣西六堡茶、云南普洱茶、四川藏茶、陜西黑茶、湖北青磚茶：市售；

炔苯酰草胺、乙草胺、異丙甲草胺、氟酰胺、丙炔氟草胺：純度99%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

丙草胺、丁草胺、異丙草胺、吡氟酰草胺、二甲草胺、甲草胺：100 mg/L，上海安譜實驗科技股份有限公司；

乙腈、乙酸乙酯：色譜純，美國TEDIA試劑公司；

丙酮：色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司；

氯化鈉：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

凈化組A[含150 mg MgSO4，50 mg C18，50 mgN-丙基乙二胺(PSA)]、凈化組B[含150 mg MgSO4，50 mg C18，50 mg PSA，10 mg 石墨化碳黑(GCB)]、凈化組C(含150 mg MgSO4，50 mg C18，50 mg PSA，50 mg GCB)：上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜—三重四極桿質(zhì)譜儀：Thermo Scientific TSQ 9000型，賽默飛世爾科技公司；

臺式離心機(jī)：TG16-WS型，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

旋渦混勻器：IKA MS3型，德國艾卡集團(tuán)；

華晨高速多功能粉碎機(jī)：HCP-1000A型，浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠；

電子分析天平：BSA124S-CW型，德國賽多利斯集團(tuán)；

超純水儀：2WM-UT1-10型，中沃水務(wù)環(huán)保科技有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液 分別準(zhǔn)確稱取炔苯酰草胺、乙草胺、異丙甲草胺、氟酰胺、丙炔氟草胺10 mg，加入少量乙酸乙酯溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配制質(zhì)量濃度為100 mg/L的單標(biāo)儲備液，-18 ℃避光貯藏。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 分別吸取10種酰胺類除草劑儲備液(100 mg/L)各0.5 mL于同一10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋并定容，配制成5.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，-18 ℃避光貯藏。

1.3.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液 用乙酸乙酯將標(biāo)準(zhǔn)中間液逐級稀釋配制成質(zhì)量濃度為0.001，0.005，0.010，0.050，0.100，0.500 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.4 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液 取經(jīng)凈化后的空白基質(zhì)溶液1 mL于40 ℃水浴下氮吹至干，精密移取1.0 mL相應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液復(fù)溶，過濾膜，配制成基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件優(yōu)化 色譜柱為TG-5 SILMS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度280 ℃；升溫程序：初始溫度120 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升溫至180 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升溫至240 ℃，以30 ℃/min升溫至300 ℃，保持 5 min。載氣為高純氦氣(純度>99.999%)；載氣控制方式為恒定流量；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣方式為不分流模式，進(jìn)樣量1 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 電子轟擊離子源(EI源)；離子源溫度300 ℃；傳輸線溫度280 ℃；碰撞氣為高純氦氣(純度>99.999%)；選取1.0 mg/L酰胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液在m/z50～500內(nèi)運行MS1全掃描，根據(jù)所得的色譜圖和質(zhì)譜圖確定保留時間和特征離子，在質(zhì)譜圖中選擇1～2個豐度較高且m/z較大的離子作為MRM方法的母離子。對母離子進(jìn)行子離子掃描和碰撞能優(yōu)化，碰撞電壓5～50 eV，每間隔5 eV進(jìn)行一次碰撞，根據(jù)碎片離子豐度，確定定性離子對和定量離子對。

1.5 樣品前處理條件優(yōu)化

1.5.1 提取溶劑優(yōu)化 稱取粉碎過篩后的黑茶樣品1.000 0 g置于50 mL塑料離心管中，按0.02 mg/kg水平添加10種酰胺類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入5 mL去離子水，渦旋混勻后靜置30 min，分別準(zhǔn)確加入10.0 mL丙酮、乙酸乙酯、乙腈，加入2 g氯化鈉，渦旋振蕩2 min，5 000 r/min離心5 min，取2 mL上清液置于離心管(已加入150 mg MgSO4，50 mg C18，50 mg PSA，10 mg GCB)中，劇烈渦旋2 min，5 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確移取1.0 mL凈化液，40 ℃水浴氮吹至干，準(zhǔn)確加入1.0 mL乙酸乙酯復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)測定目標(biāo)物的回收率。

1.5.2 凈化劑優(yōu)化 相同的提取條件下，取2 mL上清液，采用3組不同凈化組合進(jìn)行凈化，凈化組合分別為A(含150 mg MgSO4，50 mg C18，50 mg PSA)，B(含150 mg MgSO4，50 mg C18，50 mg PSA，10 mg GCB)，C(含150 mg MgSO4，50 mg C18，50 mg PSA，50 mg GCB)，劇烈渦旋2 min，5 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確移取1.0 mL凈化液，40 ℃水浴氮吹至干，準(zhǔn)確加入1.0 mL乙酸乙酯復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)測定目標(biāo)物的回收率。

1.6 基質(zhì)效應(yīng)評價

取空白黑茶樣品，按1.5的方法得到空白基質(zhì)溶液，并采用空白基質(zhì)溶液配制基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作系列，同時用溶劑配制相同濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作系列，在相同的GC-MS/MS條件下測定得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線。按式(1)計算各組分的基質(zhì)效應(yīng)[18]。

ME=(B-A)/A×100%，

(1)

式中：

ME——基質(zhì)效應(yīng)，%；

A——溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；

B——基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.7 線性范圍、檢出限和定量限測定

按1.5的方法制備空白基質(zhì)溶液，并配制質(zhì)量濃度為0.001，0.005，0.010，0.050，0.100，0.500 mg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，以各組分的峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在空白黑茶樣品中添加低濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以信噪比(S/N)為3和10時的空白樣品添加濃度計算方法的檢出限和定量限。

1.8 準(zhǔn)確度和精密度測定

選取空白黑茶樣品進(jìn)行添加回收試驗，添加水平為0.01，0.02，0.10 mg/kg，每個水平平行測定6次，測定10種酰胺類除草劑含量，計算回收率和精密度。

1.9 實際樣品的測定

根據(jù)最優(yōu)樣品前處理方式處理黑茶樣品，在優(yōu)化的儀器條件下測定黑茶樣品中10種酰胺類除草劑含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

經(jīng)全掃描模式獲得了10種酰胺類除草劑的保留時間和特征離子，選擇離子強(qiáng)度高、質(zhì)荷比較大的特征離子作為前級離子，采用產(chǎn)物離子掃描模式將各化合物的母離子打碎，并選擇2或3個強(qiáng)度大、靈敏度高的離子作為子離子，最后采用MRM 掃描模式，優(yōu)化所選取子離子的碰撞能量，選出最佳碰撞能量，10種酰胺類除草劑的質(zhì)譜信息見表1。10種酰胺類除草劑的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖如圖1所示，由圖1可知，10種酰胺類除草劑可得到有效分離，基質(zhì)干擾小。

表1 10種酰胺類除草劑的保留時間及多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)

1. 炔苯酰草胺 2. 二甲草胺 3. 乙草胺 4. 甲草胺 5. 異丙草胺 6. 異丙甲草胺 7. 丁草胺 8. 氟酰胺 9. 吡氟酰草胺 10. 丙炔氟草胺

2.2 樣品前處理條件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑 采用乙腈提取時，10種酰胺類除草劑的回收率均在85%以上，提取效率優(yōu)于丙酮和乙酸乙酯。選取丙酮或者乙酸乙酯作提取溶劑，色素等雜質(zhì)較多，提取液顏色較深，不宜凈化，基質(zhì)干擾大，而乙腈提取液顏色相對較淺，基質(zhì)干擾較小。綜合考慮，選取乙腈作為前處理提取溶劑。

2.2.2 凈化劑 PSA吸附劑可有效去除提取液中糖類、酚類、脂肪酸及極性色素等成分，C18吸附劑可去除酯類和脂肪等非極性干擾物，GCB可有效去除提取液中的色素。隨著凈化填料種類的增加，凈化液越來越澄清，且隨著GCB的引入脫色效果明顯，組合A凈化后的溶液顏色較深，組合B凈化后溶液接近無色，組合C凈化后溶液為無色。組合A凈化后的溶液中含色素雜質(zhì)多，對襯管的耗損大，影響色譜柱的使用壽命。組合B凈化后各組分的平均回收率最優(yōu)，為80%～110%(圖2)。因此，選取凈化組合B作為黑茶中酰胺類除草劑檢測的凈化劑。

圖2 3組凈化填料凈化后10種酰胺類除草劑的

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

由圖3可知，各酰胺類除草劑組分的基質(zhì)效應(yīng)為10%～50%，表明此方法檢測黑茶中10種酰胺類除草劑存在明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，因此使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法消除基質(zhì)效應(yīng)對10種除草劑定量分析的影響，以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖3 黑茶中10種酰胺類除草劑的基質(zhì)效應(yīng)

2.4 線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和檢出限

由表2可知，10種酰胺類除草劑在0.001～0.500 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均>0.999；10種酰胺類除草劑的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別為0.001～0.002 mg/kg和0.002～0.008 mg/kg。

表2 黑茶中10種酰胺類除草劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

2.5 方法的回收率和精密度

由表3可知，當(dāng)加標(biāo)濃度為0.01 mg/kg時，回收率為80.3%～102.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.7%～7.3%，當(dāng)加標(biāo)濃度為0.02 mg/kg時，回收率為85.1%～103.2%，RSD為1.1%～4.8%，當(dāng)加標(biāo)濃度為0.10 mg/kg時，回收率為86.4%～102.3%，RSD為0.9%～5.0%，表明該方法準(zhǔn)確度較高，精密度良好，能夠滿足檢測要求。

表3 黑茶中10種酰胺類除草劑的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.6 實際樣品測定

采用建立的方法對市售30份黑茶樣品進(jìn)行10種酰胺類除草劑殘留量分析，樣品品種包括湖南安化黑茶、廣西六堡茶、云南普洱茶、四川藏茶、陜西黑茶、湖北青磚茶。經(jīng)檢測所有樣品均未檢出10種酰胺類除草劑，表明黑茶中檢出酰胺類除草劑殘留的風(fēng)險較低。

3 結(jié)論

將QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合GC-MS/MS檢測手段，建立了可同時檢測黑茶中10種酰胺類除草劑殘留量的分析方法。該方法去除黑茶中基質(zhì)干擾效果好，在0.01，0.02，0.10 mg/kg 3個加標(biāo)水平下，10種酰胺類化合物的回收率為80.3%～103.2%，方法檢出限和定量限分別為0.001～0.002 mg/kg和0.002～0.008 mg/kg。該方法重復(fù)性好，精密度高，操作簡便、高效，適合于黑茶中酰胺類除草劑的定性和定量檢測。后續(xù)應(yīng)完善不同茶葉基質(zhì)中酰胺類除草劑的檢測方法，加大對不同茶葉品種的監(jiān)測。