鄭 茜，劉遠婷，丁甜甜，李 慧

(新疆醫(yī)科大學第七附屬醫(yī)院中醫(yī)科，新疆 烏魯木齊 830000)

超過70%的肺癌患者確診時已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，無法接受手術(shù)治療，而非手術(shù)治療手段不良反應(yīng)較多，腫瘤晚期患者合并多種基礎(chǔ)病，免疫力低下，無法耐受放化療，因而積極探尋新的有效治療方法是目前研究重點[1-3]。中醫(yī)學認為肺癌為本虛標實，正氣虛損、陰陽失調(diào)、六淫之邪乘虛而入，引起肺臟功能失衡，宣降失司，氣機不暢，從而血行受阻，津液輸布不暢，津聚為痰，瘀阻脈絡(luò)、痰氣瘀毒膠結(jié)，發(fā)為肺部腫塊。中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌多傾向于辨證辨病結(jié)合，扶正祛邪結(jié)合，改善患者癥狀、提高患者生存質(zhì)量、穩(wěn)定病灶、延長生存期及提高生存率，而關(guān)于中醫(yī)作用于肺癌的機制目前研究甚少[4]。Survivin蛋白是以效應(yīng)細胞蛋白酶受體cDNA在人體的基因組庫雜交篩選中分離而得，參與肺癌的發(fā)生發(fā)展[5]。本研究擬分析消積抑癌外敷方對Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長、Survivin蛋白表達的影響，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物與細胞株：選取SPF級C57BL/6小鼠60只，雌鼠、雄鼠各30只，4～9周齡，體重19～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。Lewis肺癌細胞株購自中國生命科學院上海細胞庫。

1.1.2 實驗藥物與試劑：消積抑癌外敷方組成如下：當歸、川芎、乳香、沒藥、紅花、赤芍、甲珠、丹參各30 g，五靈脂、透骨草、青黛、仙鶴草、丹皮、白鮮皮、蛇莓各60 g，莪術(shù)、苦參、山慈菇、商陸、延胡索、浙貝母、烏梅、蜂房各120 g，全蝎、蟲、拳參各40 g，蜈蚣40條，冰片9 g。以上中藥材由新疆醫(yī)科大學第七附屬醫(yī)院中藥房提供，將以上中藥以破壁機研成細粉，將冰片溶入46°白酒制備成冰片酒，調(diào)和成膏狀再消毒滅菌裝瓶封制成外敷制劑，濃縮至生藥含量為4.875 g/ml。其他試劑：胎牛血清(武漢博士德公司)，PBS(武漢博士德公司)，二抗PV-6001兔兩步法試劑盒、DAB顯色試劑盒(英國Invitrogen公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(江蘇南京凱基生物有限公司)，免疫組化染色試劑中一抗Survivin(1∶50)兔抗鼠單克隆抗體、鼠抗人單克隆抗體Anti-β-actin、兔抗人單克隆抗體Anti-survivin(美國Santa Cruz公司)。

1.1.3 實驗儀器：恒溫CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)、低溫高速離心機(3K-15型，德國Sigma公司)、顯微鏡(BX60型，日本Olympus)、病理切片機(RM2016型，上海徠卡儀器有限公司)、光譜掃描多功能酶標儀(ELX808IU型，美國Promega公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及建模：60只小鼠以隨機數(shù)字表法分為四組，每組各15只，依次為對照組、消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組、消積抑癌高劑量組。建模：選擇生長良好的對數(shù)生長期Lewis肺癌細胞，經(jīng)胰酶消化，濃度調(diào)整為1×107個/ml后均經(jīng)小鼠右側(cè)腋部皮下接種0.2 ml。在建模8 d后，可觸及皮下結(jié)節(jié)、瘤長至100～300 mm提示建模成功[6]。

1.2.2 給藥方法及取材：建模后，對照組0.80 ml/20 g0.9%氯化鈉溶液調(diào)和的面糊外敷于瘤體表面、加熱至30 ℃，3次/d，30 min/次。消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組、消積抑癌高劑量組分別予以0.20 ml/20g、0.40 ml/20g、0.80 ml/20g的消積抑癌外敷方外敷于瘤體表面、加熱至30 ℃，3次/d，30 min/次。各組均連續(xù)干預(yù)30 d后以頸椎脫臼法將小鼠處死，同時剝離各組小鼠瘤組織。

1.2.3 HE染色：取瘤旁及瘤體組織，4%中性甲醛固定后的標本經(jīng)脫水、透明、浸蠟與包埋后，制成蠟塊。以Leica RM2235石蠟切片機進行連續(xù)切片，厚度5 μm，切片經(jīng)脫蠟后予以常規(guī)的蘇木精-伊紅染色(HE染色)，光學顯微鏡下觀察組織學形態(tài)并拍照記錄。

1.2.4 抑瘤效果評估：取出完整的腫瘤組織后稱重，計算抑瘤率。抑瘤率為對照組與觀察組的平均瘤重差值占對照組平均瘤重百分比。

1.2.5 胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)：在剝離瘤體后，取小鼠胸腺、脾臟組織，稱重。胸腺指數(shù)=10×胸腺重量(g)/鼠重(g)、脾臟指數(shù)=10×脾臟重量(g)/鼠重(g)。

1.2.6 肺轉(zhuǎn)移灶個數(shù)：將雙肺完整取出后，應(yīng)用苦味酸固定，鏡下對雙肺表面轉(zhuǎn)移灶數(shù)進行統(tǒng)計。

1.2.7 免疫組化法測定Survivin蛋白表達水平：經(jīng)SP免疫組化法對腫瘤組織Survivin蛋白表達水平進行測定。取新鮮腫瘤組織，以10%中性甲醛固定24 h后切塊、脫水、石蠟包埋，以切片機切片，每蠟塊連續(xù)切片3張，厚度4～5 μm，切片脫蠟水洗后高壓熱修復(fù)，以3%H2O2阻斷過氧化酶，PBS洗滌3 min×3次，滴加一抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3 min×3次，滴加二抗，37 ℃孵育45 min，PBS洗滌3 min×3次，DAB顯色2 min，蘇木素復(fù)染，透明后封片鏡檢。嚴格依據(jù)半定量評分系統(tǒng)評定染色效果[7]，著色強度、陽性細胞所占百分比兩項乘積<3分為陰性(-)，≥3分為陽性(+)，3～5分為弱陽性(+)，6～9分為中陽性()，>9分為強陽性表達()。

1.2.8 Western blot法測定Survivin蛋白表達：取新鮮腫瘤組織并移入無菌的離心管，1000 r/min、離心5 min，以4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌2次，將殘余液體吸干后每瓶細胞加300 μl細胞裂解液，冰上搖勻30 min，待細胞充分裂解后收集到不含RNA酶的1.5 ml預(yù)冷離心管，取上清應(yīng)用BCA法定量，采用PVDF膜進行濕轉(zhuǎn)，5%脫脂奶粉行免疫印跡、封閉、孵育，將殘留的一抗洗掉后加二抗，室溫搖床1 h，洗去膜上殘留二抗，避光滴加配制好的ECL化學發(fā)光A、B混合試劑，經(jīng)數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)對PVDF膜進行掃描，按照內(nèi)參條帶測出目的條數(shù)，計算相對表達量。相對表達量=目的條帶灰度值/內(nèi)參灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 瘤旁及瘤體組織的HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果(圖1)可見瘤旁組織的肺泡未增厚，腺圈不明顯；瘤體組織見肺泡壁明顯增厚，觀察到肺腺癌的病理特征，腺圈明顯。

2.2 各組小鼠體重、瘤重、抑瘤率比較 各組小鼠體重兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義 (均P>0.05)。消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組、消積抑癌高劑量組小鼠瘤重均低于對照組，且消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組、消積抑癌高劑量組小鼠瘤重依次降低，而抑瘤率逐漸增加，三組組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠體重、瘤重、抑瘤率比較

2.3 各組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)比較 消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組、消積抑癌高劑量組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均高于對照組(P<0.05)。消積抑癌高劑量組胸腺指數(shù)高于消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；消積抑癌高劑量組、消積抑癌中劑量組小鼠脾臟指數(shù)高于消積抑癌低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)比較(mg/10 g)

2.4 各組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶個數(shù)比較 對照組肺轉(zhuǎn)移灶平均(14.23±1.56)個>消積抑癌低劑量組(10.12±1.35)個>消積抑癌中劑量組(8.49±0.88)個>消積抑癌高劑量組(6.43±0.67)個。消積抑癌不同劑量組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

2.5 各組小鼠Survivin蛋白表達比較 對照組Survivin蛋白積分、Survivin蛋白陽性率及Survivin蛋白相對表達量均高于不同劑量的消積抑癌組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。消積抑癌高劑量組Survivin蛋白積分、Survivin蛋白陽性率及Survivin蛋白相對表達量最低。見表3(圖2、3)。

表3 各組小鼠Survivin蛋白表達比較

A：對照組；B：消積抑癌低劑量組；C：消積抑癌中劑量組；D：消積抑癌高劑量組

A：對照組；B：消積抑癌低劑量組；

3 討 論

肺癌為臨床常見的惡性腫瘤，肺癌的發(fā)病率和病死率逐年攀升[8-9]。手術(shù)、放化療為肺癌的主要治療方案，近年來中醫(yī)藥治療逐漸受到關(guān)注。中醫(yī)認為肺癌以肺脾虛為本，痰瘀為標，久病及腎；肺癌證型主要有氣滯、血瘀、痰濕、熱毒等，依據(jù)臨床表現(xiàn)可歸于“咳嗽”“痰飲”“息奔” “肺積” “咯血” “肺花瘡” “胸痛”等范疇[10]。蔣艷玲等[11]發(fā)現(xiàn)，中藥化痰消瘤方能對Lewis荷瘤小鼠發(fā)揮抑瘤作用，并對抗肺癌轉(zhuǎn)移，且以高劑量組療效最顯著，其作用機制可能是上調(diào)腫瘤E-cad表達，導致腫瘤細胞間黏附增加，使其向周圍組織侵襲力減輕，且可顯著下調(diào)腫瘤細胞的表達，減輕腫瘤細胞與基質(zhì)間的黏附，使腫瘤細胞侵襲及轉(zhuǎn)移受到抑制。Survivin為凋亡基因，其能抑制凋亡，調(diào)節(jié)細胞分裂，于多種惡性腫瘤中高表達，而正常組織中幾乎不表達[12]。李興培教授提出治療肺癌的臨床方案為以扶正消積湯內(nèi)服聯(lián)合消積抑癌外用方，或單用消積抑癌外用方，與西醫(yī)放、化療有機結(jié)合，可緩解患者癥狀并穩(wěn)定病灶，提高放化療效果，使患者帶瘤生存水平提升，增強機體的免疫功能，減輕放化療所致消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)的不良反應(yīng)。因此本研究建立Lewis肺癌荷瘤模型，分析消積抑癌方外敷治療的抑瘤作用及其作用機制，為后續(xù)臨床治療提供理論依據(jù)。

本次通過建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型，分析本院消積抑癌外敷方對其腫瘤生長的影響，從結(jié)果來看Lewis肺癌荷瘤小鼠予以消積抑癌外敷方后可起到抑制腫瘤生長、減少腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。此外本次研究發(fā)現(xiàn)，隨消積抑癌外敷方給藥劑量增加，Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤重逐漸減少，抑瘤率逐漸增加，說明其治療效果呈劑量依賴性抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠的腫瘤生長，這與周婷婷等[13]的研究結(jié)論吻合。

本次采用的消積抑癌外敷方由新疆名中醫(yī)李興培教授創(chuàng)制，李教授論治腫瘤的辨證思想融合了金元時期張從正和張元素的學術(shù)主張。張從正認為：“蓋邪未去而不可言補，補之則適足資寇”“損其有余所以補不足也”。張元素認為：“養(yǎng)正積自除”。故李興培教授取兩家之長，以“攻補兼施”為指導思想，創(chuàng)制了扶正消積湯(內(nèi)服方)和消積抑癌外用方，內(nèi)服“補其不足”，外敷“損其有余”。消積抑癌外敷方中多選用蟲類藥以通絡(luò)消積、以毒攻毒；選用活血破瘀消積藥以清瘀毒，如當歸、川芎、乳香、沒藥等；選用清熱解毒散結(jié)藥物如苦參、山慈菇、商陸等[8]；輔以冰片、白酒的辛散透皮，引藥到達病所；諸藥配伍可發(fā)揮清熱解毒、活血消積、以毒攻毒等功效[14-16]。現(xiàn)代藥理研究表明當歸[17]、川芎[18]可活血、補血，抑制Lewis小鼠移植瘤生長，其作用機制可能是直接作用于癌細胞，發(fā)揮抗血管生成作用；紅花中紅花黃色素可較好緩解及保護呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病[19]；莪術(shù)[20]、赤芍[21]、丹參[22]能較好抑制腫瘤組織轉(zhuǎn)移、血管生成，誘導腫瘤細胞凋亡，并能調(diào)節(jié)機體免疫功能、抑制肺間質(zhì)纖維化。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)消積抑癌外敷方高劑量組的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)較消積抑癌外敷方低劑量組、消積抑癌外敷方中劑量組高，消積抑癌外敷方中劑量組脾臟指數(shù)高于消積抑癌外敷方低劑量組，這與謝英瑛[16]的報道結(jié)果相似，說明消積抑癌外敷方可提高Lewis肺癌荷瘤小鼠的免疫器官指數(shù)，保護小鼠免疫功能，增強腫瘤的免疫應(yīng)答水平，且呈劑量依賴性，這可能和中藥活性成分發(fā)揮藥理作用有關(guān)系，其具體機制可在后期研究中進一步探討。

Survivin為最強的凋亡抑制因子，也是唯一和細胞周期有密切關(guān)系的IAP家族成員，通過BIR重要序列抑制Caspase依賴的細胞凋亡途徑；Survivin也可促進p21與線粒體中Caspase-3結(jié)合，而明顯抑制Caspase活性，促進細胞分裂，抑制細胞凋亡[23-24]。本研究中對照組Survivin蛋白積分、陽性率與相對表達量均高于消積抑癌外敷方各劑量組，其中消積抑癌外敷方高劑量組的Survivin蛋白積分、陽性率與相對表達量最少，表明消積抑癌外敷方可抑制Lewis小鼠Survivin蛋白表達。李巧玲[25]發(fā)現(xiàn)，愛康方(組方：生薏苡仁、通關(guān)藤、金蕎麥、桃仁、紫珠葉、臭殼蟲、花蕊石、三七、血余炭)對人肺腺癌A549、小鼠Lewis細胞內(nèi)的Survivin蛋白及基因表達有一定影響。此外也有研究發(fā)現(xiàn)Survivin是細胞周期調(diào)節(jié)基因，其表達和肺癌的癌細胞周期密切相關(guān)，半衰期僅30 min，于細胞周期G2M期有一定表達，而隨后G1期的mRNA及蛋白表達水平快速下降，Survivin在腫瘤細胞中表達水平升高，抑制癌細胞凋亡，促進癌細胞侵襲周圍組織，導致轉(zhuǎn)移[26]。但本次未對Lewis荷瘤小鼠的細胞周期進行研究，關(guān)于Survivin蛋白對Lewis肺癌荷瘤小鼠的細胞周期調(diào)控作用值得進一步探究。

綜上所述，消積抑癌外敷方能較好地抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長及Survivin蛋白表達，且呈劑量依賴性。