王 琪，梁曉東，邱 靜，王婷婷，張桂春，時(shí)瀟洋，宋建祥

食管癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤，以鱗狀細(xì)胞癌為主要類型。2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，食管癌發(fā)病率和病死率均較高[1]。食管癌早期缺乏典型臨床表現(xiàn)，若出現(xiàn)進(jìn)行性吞咽困難等癥狀時(shí)已為中晚期，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是影響食管癌患者預(yù)后的主要因素[2]。因此，尋找食管癌侵襲性生物學(xué)行為的分子標(biāo)志物及機(jī)制是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。B7-H3是協(xié)同刺激分子B7家族的新成員，在腫瘤免疫逃逸中起重要的調(diào)節(jié)作用，在多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[3-4]。CD44屬于細(xì)胞黏附分子家族，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，在多種惡性腫瘤細(xì)胞表面呈高度活化狀態(tài)，是重要的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，并參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程[5-6]。本文著重探討B(tài)7-H3和CD44在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系，并分析兩者在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年2月～2019年5月江蘇省鹽城市第三人民醫(yī)院病理科存檔的食管癌根治標(biāo)本128例，其中男性89例，女性39例，患者年齡49～90歲，中位年齡67歲。所有患者術(shù)前均未行放、化療及免疫治療，患者均有完整的臨床病理資料，所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌。采用食管癌美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)第八版進(jìn)行pTNM分期，其中Ⅰ期25例，Ⅱ期52例，Ⅲ期44例，Ⅳ期7例；癌組織侵犯黏膜固有層、黏膜肌層或黏膜下層33例(T1)，侵犯固有肌層18例(T2)，侵犯外膜75例(T3)，侵入相鄰結(jié)構(gòu)2例(T4)；分化程度：高分化31例，中分化78例，低分化19例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者59例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者69例。另取同期64例癌旁正常組織(距腫瘤>5 cm組織)為對(duì)照組。

1.2 免疫組化標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林充分固定后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)3 μm厚切片。采用免疫組化SP法檢測(cè)標(biāo)本中B7-H3(小鼠單克隆抗體，克隆號(hào)6A1)、CD44(兔單克隆抗體，克隆號(hào)EP44)的表達(dá)。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟至水化，高壓鍋高溫高壓進(jìn)行抗原修復(fù)后，3%過(guò)氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。滴加濃度為1 ∶200的B7-H3與即用型CD44抗體進(jìn)行一抗4 ℃孵育過(guò)夜，使用二抗室溫孵育15 min，DAB顯色3～5 min。蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封固，鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判斷由兩位主治以上的病理醫(yī)師采用雙盲法閱片。B7-H3、CD44蛋白均于腫瘤細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)著色。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)200倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。(1)按細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘。B7-H3蛋白表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：0分為(-)，1～2分為(+)，3～4分為()，>4分為()；CD44判定標(biāo)準(zhǔn)：0～2分為(-)，3～4分為(+)，5～8分為()，>8分為()。將(-)為陰性，(+～)為陽(yáng)性，其中(+)為低表達(dá)組，(～)為高表達(dá)組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。食管鱗狀細(xì)胞癌與癌旁正常組織中B7-H3、CD44的表達(dá)差異及兩者與臨床病理特征之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)、連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。采用Pearson相關(guān)性分析法分析食管鱗狀細(xì)胞癌組織中B7-H3與CD44表達(dá)的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗狀細(xì)胞癌及癌旁正常組織中B7-H3、CD44蛋白的表達(dá)128例食管鱗狀細(xì)胞癌中，B7-H3的陽(yáng)性率為92.97%(119/128)，其中56例為低表達(dá)，63例為高表達(dá)；64例癌旁正常組織中，B7-H3的陽(yáng)性率為1.56%(1/64)，均為低表達(dá)。128例食管鱗狀細(xì)胞癌中，CD44的陽(yáng)性率為82.03%(105/128)，其中33例為低表達(dá)，72例為高表達(dá)；64例癌旁正常組織中，CD44的陽(yáng)性率為18.75%(12/64)，均為低表達(dá)。B7-H3、CD44蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性率明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1，圖1)。

圖1 食管鱗狀細(xì)胞癌及癌旁正常組織中B7-H3、CD44的表達(dá)：A.B7-H3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)；B.B7-H3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達(dá)；C.B7-H3在癌旁正常組織中不表達(dá)；D.CD44在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)；E.CD44在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達(dá)；F.CD44在癌旁正常組織中不表達(dá)，SP法

表1 食管鱗狀細(xì)胞癌及癌旁正常組織中B7-H3、CD44的表達(dá)

2.2 食管鱗狀細(xì)胞癌中B7-H3、CD44表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系食管鱗狀細(xì)胞癌中，B7-H3高表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、pTNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫塊大小無(wú)關(guān)(P>0.05)。CD44高表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、pTNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫塊大小、腫瘤分化程度均無(wú)關(guān)(P>0.05，表2)。

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中B7-H3和CD44表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中B7-H3與CD44表達(dá)的相關(guān)性食管鱗狀細(xì)胞癌組織中，B7-H3與CD44的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.333，P<0.05，表3)。

表3 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中B7-H3與CD44表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

食管癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，晚期食管癌患者術(shù)后5年生存率不足15%[8]，主要原因是腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。因此，闡明食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制可有助于預(yù)測(cè)其臨床生物學(xué)行為。

B7家族是最基本的協(xié)同刺激分子，具有共刺激/共抑制作用，其中B7-H3是B7家族的新成員，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)揮腫瘤免疫逃逸作用。大量研究[10-12]發(fā)現(xiàn)B7-H3可促進(jìn)子宮頸癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B7-H3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中陽(yáng)性率高于癌旁正常組織，且高表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、pTNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Song等[13]的研究結(jié)果證實(shí)B7-H3高表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌浸潤(rùn)深度和臨床分期有關(guān)，與本組結(jié)果一致。此外，本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)B7-H3與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，提示B7-H3與食管癌侵襲性生物學(xué)行為密切相關(guān)。

CD44屬于細(xì)胞黏附分子家族，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，在惡性腫瘤細(xì)胞中可異常高表達(dá)，一方面可通過(guò)改變腫瘤周圍微環(huán)境及增加血管生成促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，另一方面與透明質(zhì)酸結(jié)合可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活、增殖和轉(zhuǎn)移[14]。CD44同時(shí)也是腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，在卵巢癌、腎癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中高表達(dá)，并與腫瘤浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和更差的預(yù)后相關(guān)[15-17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌中CD44陽(yáng)性率明顯高于癌旁正常組織，其高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)CD44在食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，與腫瘤浸潤(rùn)深度、pTNM分期有關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株里轉(zhuǎn)染B7-H3后CD44表達(dá)明顯升高，B7-H3被抑制后CD44表達(dá)明顯降低，而B(niǎo)7-H3可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，后者又可通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路增加CD44等腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性，提高侵襲及轉(zhuǎn)移能力[19-21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示B7-H3及CD44兩者表達(dá)呈正相關(guān)，提示B7-H3也可能通過(guò)促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化激活Wnt信號(hào)通路，上調(diào)CD44的表達(dá)，獲得干細(xì)胞特性，進(jìn)一步提高食管癌細(xì)胞浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移能力，但仍需進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，B7-H3、CD44的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌侵襲性生物學(xué)行為關(guān)系密切，兩者表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示兩者協(xié)同促進(jìn)食管癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，兩者聯(lián)合檢測(cè)可有助于預(yù)測(cè)食管癌的臨床生物學(xué)行為。