王 琪，梁曉東，邱 靜，王婷婷，張桂春，時瀟洋，宋建祥

食管癌是消化道最常見的惡性腫瘤，以鱗狀細胞癌為主要類型。2018年全球癌癥統(tǒng)計報告顯示，食管癌發(fā)病率和病死率均較高[1]。食管癌早期缺乏典型臨床表現(xiàn)，若出現(xiàn)進行性吞咽困難等癥狀時已為中晚期，腫瘤侵襲和轉移是影響食管癌患者預后的主要因素[2]。因此，尋找食管癌侵襲性生物學行為的分子標志物及機制是當前研究的熱點。B7-H3是協(xié)同刺激分子B7家族的新成員，在腫瘤免疫逃逸中起重要的調(diào)節(jié)作用，在多種惡性腫瘤中異常高表達，并促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲[3-4]。CD44屬于細胞黏附分子家族，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，在多種惡性腫瘤細胞表面呈高度活化狀態(tài)，是重要的腫瘤干細胞標志物，并參與腫瘤侵襲、轉移過程[5-6]。本文著重探討B(tài)7-H3和CD44在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及與臨床病理特征的關系，并分析兩者在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年2月～2019年5月江蘇省鹽城市第三人民醫(yī)院病理科存檔的食管癌根治標本128例，其中男性89例，女性39例，患者年齡49～90歲，中位年齡67歲。所有患者術前均未行放、化療及免疫治療，患者均有完整的臨床病理資料，所有標本均經(jīng)病理證實為鱗狀細胞癌。采用食管癌美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)第八版進行pTNM分期，其中Ⅰ期25例，Ⅱ期52例，Ⅲ期44例，Ⅳ期7例；癌組織侵犯黏膜固有層、黏膜肌層或黏膜下層33例(T1)，侵犯固有肌層18例(T2)，侵犯外膜75例(T3)，侵入相鄰結構2例(T4)；分化程度：高分化31例，中分化78例，低分化19例；有淋巴結轉移者59例，無淋巴結轉移者69例。另取同期64例癌旁正常組織(距腫瘤>5 cm組織)為對照組。

1.2 免疫組化標本均經(jīng)10%中性福爾馬林充分固定后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)3 μm厚切片。采用免疫組化SP法檢測標本中B7-H3(小鼠單克隆抗體，克隆號6A1)、CD44(兔單克隆抗體，克隆號EP44)的表達。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟至水化，高壓鍋高溫高壓進行抗原修復后，3%過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加濃度為1 ∶200的B7-H3與即用型CD44抗體進行一抗4 ℃孵育過夜，使用二抗室溫孵育15 min，DAB顯色3～5 min。蘇木精復染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固，鏡下觀察。

1.3 結果判斷由兩位主治以上的病理醫(yī)師采用雙盲法閱片。B7-H3、CD44蛋白均于腫瘤細胞膜和(或)細胞質著色。每張切片隨機選取10個200倍視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞。(1)按細胞著色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽性細胞百分比計分：<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；將兩項得分結果相乘。B7-H3蛋白表達判定標準：0分為(-)，1～2分為(+)，3～4分為()，>4分為()；CD44判定標準：0～2分為(-)，3～4分為(+)，5～8分為()，>8分為()。將(-)為陰性，(+～)為陽性，其中(+)為低表達組，(～)為高表達組。

1.4 統(tǒng)計學方法應用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。食管鱗狀細胞癌與癌旁正常組織中B7-H3、CD44的表達差異及兩者與臨床病理特征之間的關系采用χ2檢驗、連續(xù)校正χ2檢驗或Fisher精確概率法。采用Pearson相關性分析法分析食管鱗狀細胞癌組織中B7-H3與CD44表達的相關性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 食管鱗狀細胞癌及癌旁正常組織中B7-H3、CD44蛋白的表達128例食管鱗狀細胞癌中，B7-H3的陽性率為92.97%(119/128)，其中56例為低表達，63例為高表達；64例癌旁正常組織中，B7-H3的陽性率為1.56%(1/64)，均為低表達。128例食管鱗狀細胞癌中，CD44的陽性率為82.03%(105/128)，其中33例為低表達，72例為高表達；64例癌旁正常組織中，CD44的陽性率為18.75%(12/64)，均為低表達。B7-H3、CD44蛋白在食管鱗狀細胞癌組織中的陽性率明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1，圖1)。

圖1 食管鱗狀細胞癌及癌旁正常組織中B7-H3、CD44的表達：A.B7-H3在食管鱗狀細胞癌組織中高表達；B.B7-H3在食管鱗狀細胞癌組織中低表達；C.B7-H3在癌旁正常組織中不表達；D.CD44在食管鱗狀細胞癌組織中高表達；E.CD44在食管鱗狀細胞癌組織中低表達；F.CD44在癌旁正常組織中不表達，SP法

表1 食管鱗狀細胞癌及癌旁正常組織中B7-H3、CD44的表達

2.2 食管鱗狀細胞癌中B7-H3、CD44表達與臨床病理特征的關系食管鱗狀細胞癌中，B7-H3高表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、pTNM分期及淋巴結轉移有關(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫塊大小無關(P>0.05)。CD44高表達與腫瘤浸潤深度、pTNM分期及淋巴結轉移有關(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫塊大小、腫瘤分化程度均無關(P>0.05，表2)。

表2 食管鱗狀細胞癌組織中B7-H3和CD44表達與臨床病理特征的關系

2.3 食管鱗狀細胞癌組織中B7-H3與CD44表達的相關性食管鱗狀細胞癌組織中，B7-H3與CD44的表達呈正相關(r=0.333，P<0.05，表3)。

表3 食管鱗狀細胞癌組織中B7-H3與CD44表達的相關性

3 討論

食管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，晚期食管癌患者術后5年生存率不足15%[8]，主要原因是腫瘤浸潤和轉移。因此，闡明食管癌侵襲轉移的分子機制可有助于預測其臨床生物學行為。

B7家族是最基本的協(xié)同刺激分子，具有共刺激/共抑制作用，其中B7-H3是B7家族的新成員，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中通過負性調(diào)節(jié)T細胞免疫應答發(fā)揮腫瘤免疫逃逸作用。大量研究[10-12]發(fā)現(xiàn)B7-H3可促進子宮頸癌、卵巢癌、非小細胞肺癌等腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。本實驗結果顯示，B7-H3在食管鱗狀細胞癌組織中陽性率高于癌旁正常組織，且高表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、pTNM分期及淋巴結轉移有關。Song等[13]的研究結果證實B7-H3高表達與食管鱗狀細胞癌浸潤深度和臨床分期有關，與本組結果一致。此外，本實驗亦發(fā)現(xiàn)B7-H3與淋巴結轉移關系密切，提示B7-H3與食管癌侵襲性生物學行為密切相關。

CD44屬于細胞黏附分子家族，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，在惡性腫瘤細胞中可異常高表達，一方面可通過改變腫瘤周圍微環(huán)境及增加血管生成促進腫瘤細胞的生長，另一方面與透明質酸結合可促進腫瘤細胞的存活、增殖和轉移[14]。CD44同時也是腫瘤干細胞標志物，在卵巢癌、腎癌、非小細胞肺癌等腫瘤中高表達，并與腫瘤浸潤、淋巴結轉移和更差的預后相關[15-17]。本實驗發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細胞癌中CD44陽性率明顯高于癌旁正常組織，其高表達與淋巴結轉移有關，與文獻報道一致[18]。本實驗亦發(fā)現(xiàn)CD44在食管鱗狀細胞癌中高表達，與腫瘤浸潤深度、pTNM分期有關。

有研究發(fā)現(xiàn)結直腸癌SW480細胞株里轉染B7-H3后CD44表達明顯升高，B7-H3被抑制后CD44表達明顯降低，而B7-H3可促進結直腸癌細胞的上皮-間充質轉化，后者又可通過激活Wnt信號通路增加CD44等腫瘤干細胞標志物的表達，促進腫瘤細胞獲得干細胞特性，提高侵襲及轉移能力[19-21]。本實驗結果顯示B7-H3及CD44兩者表達呈正相關，提示B7-H3也可能通過促進上皮-間充質轉化激活Wnt信號通路，上調(diào)CD44的表達，獲得干細胞特性，進一步提高食管癌細胞浸潤及轉移能力，但仍需進一步證實。

綜上所述，B7-H3、CD44的表達與食管鱗狀細胞癌侵襲性生物學行為關系密切，兩者表達水平與腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移相關，提示兩者協(xié)同促進食管癌細胞的侵襲轉移，兩者聯(lián)合檢測可有助于預測食管癌的臨床生物學行為。