劉玉東，郭明麗，韓曉麗，張慧平，宋曉飛，李 娟

喉癌是全球范圍內(nèi)頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率和病死率，其最常見(jiàn)的組織學(xué)類型為喉鱗狀細(xì)胞癌[1]。目前喉鱗狀細(xì)胞癌的治療技術(shù)取得巨大的進(jìn)步，但患者5年生存率在過(guò)去40年中僅從63%上升到66%[2]。早期喉鱗狀細(xì)胞癌的治愈率為80%～90%，而晚期腫瘤由于浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移致患者的治愈率僅為40%[3-4]。因此，尋找喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的分子標(biāo)志物顯得尤為重要，從而為喉鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷及治療提供有益的手段[5-6]。研究表明Slug(又稱Snail2)蛋白通過(guò)抑制E-cadherin表達(dá)促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。本文著重探討Slug在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義，以期為喉鱗狀細(xì)胞癌的治療和預(yù)后評(píng)估提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2010年1月～2019年1月河北省人民醫(yī)院存檔的115例喉組織標(biāo)本，其中包括30例癌旁正常喉組織、30例喉部鱗狀上皮高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、55例喉鱗狀細(xì)胞癌。所有標(biāo)本均經(jīng)石蠟包埋制成HE切片，55例喉鱗狀細(xì)胞癌經(jīng)兩名主治或主治以上病理醫(yī)師明確診斷均為原發(fā)，且患者術(shù)前均未接受放、化療。部分喉組織離體后立即放入液氮，后移入-80 ℃冰箱保存，用于Western blot的蛋白定量檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 細(xì)胞及主要試劑喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(AMC-HN-8)購(gòu)自ATCC(美國(guó)菌種收集中心)；免疫組化SP試劑盒、DAB顯色、檸檬酸修復(fù)液及PBS緩沖液，均購(gòu)自福州邁新公司；鼠抗人Slug購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，β-actin購(gòu)自北京中杉金橋公司；Trizol試劑購(gòu)自北京索萊寶公司；cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自北京天根生化公司；SYBR Green試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；Slug的敲降載體由蘇州吉瑪生物公司合成；18S和Slug引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成；胎牛血清及Lipofectamine 3000 試劑，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 免疫組化染色及結(jié)果判定所有組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋制成4 μm厚連續(xù)切片，切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯至水，高溫高壓抗原修復(fù)，免疫組化采用SP法染色，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。其中一抗稀釋濃度為Slug(1 ∶200)。Slug陽(yáng)性顯色為細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(400×)，每高倍視野計(jì)數(shù)200個(gè)目的細(xì)胞。(1)按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分；(2)按陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。兩者得分結(jié)果相乘：<3者為陰性、≥3為陽(yáng)性。

1.4 Western blot法收集新鮮正常喉組織、喉部鱗狀上皮高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及喉鱗狀細(xì)胞癌組織，勻漿靜置，加入裂解液充分裂解，4 ℃下15 000 r/min低溫高速離心30 min，提上清為總蛋白。上樣量為120 μg，聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳(4%濃縮膠電壓80 V，10%分離膠電壓120 V)，恒壓轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉，一抗Slug(1 ∶150)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫下孵育2 h，ECL發(fā)光。結(jié)果經(jīng)自動(dòng)凝膠成像分析儀采集，用β-actin作為內(nèi)參，對(duì)目的蛋白進(jìn)行灰度值測(cè)定。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株AMC-HN-8在37 ℃、5%CO2條件下，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染si-Slug，24 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率同時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA成分，分光光度計(jì)測(cè)得RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，隨后使用SYBR Green試劑盒在熒光定量PCR儀(ABI 7300)行qRT-PCR檢測(cè)。使用18S作為內(nèi)參基因。Slug上游引物：5′-TGGCTGTT GGATTTGCATGA-3′；下游引物：5′-CTGGGGGCA GTTTCACAGAA-3′，18S上游引物：5′-CGCCGCT AGAGGTGAAATTC-3′；下游引物：5′-CCAGTCGG CATCGTTTATGG-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算Slug的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)在孔徑為8 μm的Transwell小室(美國(guó)康寧公司)中分別加或不加基底膠(美國(guó)康寧公司)，進(jìn)行侵襲及遷移分析。將轉(zhuǎn)染48 h后的2.5×104個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)于200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基的上室中，將600 μL含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基加入下室。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用棉簽去除上室上表面的細(xì)胞，將上室下表面的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定后，并用0.01%結(jié)晶紫溶液染色。鏡下每個(gè)小室隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，了解遷移及侵襲情況。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn)在喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞被轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，直至90%融合。用200 μL無(wú)菌微管尖端在培養(yǎng)皿中部畫(huà)一條垂直線，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別于0 h和24 h拍攝圖像。

1.9 隨訪喉鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)后均進(jìn)行定期隨訪，中途死亡、刪失者以最后一次隨訪時(shí)間為其終止時(shí)間，其余患者隨訪截至2019年10月31日。采用門(mén)診隨訪、電話隨訪以及患者復(fù)查的方式，每3～6個(gè)月進(jìn)行1次隨訪。

2 結(jié)果

2.1 喉鱗狀細(xì)胞癌中Slug的表達(dá)Slug主要表達(dá)于細(xì)胞核中，呈棕褐色(圖1)。Slug在正常喉組織、喉部鱗狀上皮高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性率分別為16.7%(5/30)、43.3%(13/30)、74.5%(41/55)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：Slug在喉鱗狀細(xì)胞癌癌變過(guò)程中表達(dá)逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=27.061，P<0.001)。Slug表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床分期(P=0.008)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.004)密切相關(guān)(表1)，而與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、年齡、性別及腫瘤部位均無(wú)關(guān)(P均>0.05，表1)。

表1 喉鱗狀細(xì)胞癌中Slug表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

圖1 Slug在喉組織中的表達(dá)：A.在喉正常組織中呈陰性；B.在喉高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變中部分呈陽(yáng)性；C.在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中呈彌漫陽(yáng)性，SP法

2.2 Western blot檢測(cè)在正常喉組織和喉鱗狀細(xì)胞癌組織中，Slug的相對(duì)表達(dá)量分別為0.13±0.03和0.45±0.05。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，Slug在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-27.691，P<0.001，圖2)。

圖2 喉組織中Slug的表達(dá)：N1～N3代表正常喉組織；C1～C3代表喉鱗狀細(xì)胞癌組織

2.3 Slug對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響當(dāng)轉(zhuǎn)染si-Slug后，Slug在AMC-HN-8細(xì)胞中的表達(dá)量明顯降低，其下游上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition， EMT)相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)增高(圖3)。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)敲降Slug表達(dá)后喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移能力明顯下降(P<0.01,圖4)。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，敲降Slug表達(dá)后喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯下降(P<0.01,圖5)。

圖3 轉(zhuǎn)染si-Slug后喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中Slug的表達(dá)：A.RT-qPCR驗(yàn)證si-Slug敲降效率，*P<0.05；B.Western blot法驗(yàn)證Slug siRNA抑制Slug表達(dá)后，E-cadherin蛋白水平上調(diào)；1.Untreated組；2.陰性對(duì)照；3.轉(zhuǎn)染Slug siRNA組

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)：A.當(dāng)敲降Slug表達(dá)后，喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移能力下降；B.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，**P<0.01

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)：A.敲降Slug表達(dá)后，喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力；B.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，**P<0.01

2.4 Slug與喉鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系單因素分析顯示：Slug陽(yáng)性(χ2=9.282，P=0.002)、臨床分期(χ2=15.072，P<0.001)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=11.464，P<0.001)均與5年生存期密切相關(guān)。Slug陽(yáng)性者和陰性者的中位生存時(shí)間分別為(39±5)個(gè)月和(60±1)個(gè)月，Slug陽(yáng)性者的5年生存時(shí)間明顯縮短(χ2=9.282，P<0.01，圖6)。將單因素分析中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變量納入Cox多變量回歸分析，結(jié)果表明：Slug表達(dá)(B=1.737，HR=5.683)、臨床分期(B=1.284，HR=3.612)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(B=0.998，HR=2.712)均是喉鱗狀細(xì)胞癌的危險(xiǎn)因素(P均<0.05)，提示Slug陽(yáng)性是喉鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。

圖6 Slug表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌患者總生存期的關(guān)系：A.Slug表達(dá)；B.臨床分期；C.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

3 討論

引起喉癌患者死亡和影響患者生存期的主要因素是浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。EMT是上皮細(xì)胞向間充質(zhì)/間葉細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的生物學(xué)過(guò)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移及侵襲能力，是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的標(biāo)志性事件[8]。EMT轉(zhuǎn)變過(guò)程涉及多種轉(zhuǎn)錄因子的參與，包括E-cadherin、Snail家族、Twist家族等。鋅指轉(zhuǎn)錄蛋白Snail家族是較早發(fā)現(xiàn)的一類EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族，家族成員包含Snail1(Snail)、Snail2(Slug)和Snail3，Slug位于染色體8q11.21，cDNA總長(zhǎng)度為2.4 kb，其C-端包含DNA特定序列的鋅指結(jié)構(gòu)域，特異性與E-box(CAGGTG)基序結(jié)合，其N-端具有作為轉(zhuǎn)錄阻遏物的SNAG結(jié)構(gòu)域，其中間區(qū)具有豐富的脯氨酸結(jié)構(gòu)域，Slug可與E-cadherin起始元件E-box結(jié)合，從而抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，降低細(xì)胞間黏附力，促使腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病變部位向其他器官遷移，從而在EMT的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[9]。Slug在人類多種腫瘤中的表達(dá)已得到驗(yàn)證，包括乳腺癌[10]、子宮內(nèi)膜癌[11]、胰腺癌[12]、結(jié)直腸癌[13]、非小細(xì)胞肺癌[14]及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[15]等，并且與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Gu等[16]發(fā)現(xiàn)，抑制Slug表達(dá)能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。本組通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲低Slug表達(dá)可以抑制喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移及侵襲，促進(jìn)E-cadherin表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]。Western blot結(jié)果顯示，Slug從正常喉組織到喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)量逐漸增加；與Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，免疫組化結(jié)果顯示在喉鱗狀細(xì)胞癌癌變過(guò)程中Slug的陽(yáng)性率逐漸升高，可推測(cè)Slug在喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展中起促進(jìn)作用。同時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，喉鱗狀細(xì)胞癌組織中Slug表達(dá)隨著臨床分期的增高而增加，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示Slug可能與喉鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。

越來(lái)越多的研究表明，Slug可在多種腫瘤復(fù)發(fā)和患者預(yù)后過(guò)程中發(fā)揮生物學(xué)作用。在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌及卵巢癌的研究中表明，Slug陽(yáng)性者更易復(fù)發(fā)，且患者的無(wú)瘤生存期及5年生存期也比陰性者明顯縮短，提示患者預(yù)后不良，Slug能夠使癌細(xì)胞對(duì)順鉑、他莫昔芬和酪氨酸激酶抑制劑產(chǎn)生耐藥性，干擾Slug表達(dá)后可顯著提高抗腫瘤藥物的療效[10-11，17]，可用于腫瘤的治療。進(jìn)一步結(jié)合患者的臨床隨訪資料進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)，Slug表達(dá)、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者5年生存率和生存時(shí)間有關(guān)，與Slug陰性者相比，Slug陽(yáng)性患者的5年生存率下降，生存期明顯縮短，提示患者預(yù)后不良。多因素分析結(jié)果提示，Slug表達(dá)、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均為喉鱗狀細(xì)胞癌的危險(xiǎn)因素，提示Slug可作為判斷喉鱗狀細(xì)胞癌患者生存率和生存時(shí)間的參考指標(biāo)，對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌具有一定的預(yù)后評(píng)價(jià)作用。

綜上所述，Slug在喉鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用，其高表達(dá)提示患者預(yù)后不良，針對(duì)Slug的治療有可能為喉鱗狀細(xì)胞癌患者制定新的靶向治療策略。然而，腫瘤的進(jìn)展轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜且涉及多因素的過(guò)程，喉鱗狀細(xì)胞癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為受多種機(jī)制的調(diào)控，患者的預(yù)后受多種因素的影響，本組只是初步的驗(yàn)證，還需積累更多病例進(jìn)一步分析。