孔 輝，彭子珊，趙 菁，侯英勇，盧韶華

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，也是病死率最高的惡性腫瘤[1]。侵襲、轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者生存率低的主要因素，肺癌侵襲轉(zhuǎn)移途徑主要有3種，即淋巴管侵犯、血管侵犯及胸膜侵犯。文獻(xiàn)報(bào)道[2]肺癌有一種新型侵襲轉(zhuǎn)移方式，即沿氣腔播散(spread through air space, STAS)，并納入WHO(2015)肺腫瘤病理診斷指南。STAS定義為腫瘤細(xì)胞播散至周圍肺泡腔內(nèi)，以單個(gè)細(xì)胞、微乳頭或?qū)嵭约?xì)胞簇的形態(tài)游離存在，且距腫瘤主體至少間隔一個(gè)肺泡腔的距離。研究發(fā)現(xiàn)，STAS與肺癌預(yù)后密切相關(guān)[3]。本文主要探討Ⅰ期肺腺癌中STAS的臨床病理特征，并初步分析STAS形成的相關(guān)機(jī)制，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2007年1月～2011年7月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院行外科手術(shù)治療，且術(shù)后病理證實(shí)為Ⅰ期(參考第八版TNM分期[4])肺腺癌412例，患者臨床病理資料完整，隨訪1～77個(gè)月，中位隨訪時(shí)間37個(gè)月。原位癌及微浸潤性腺癌、術(shù)前接受放、化療者均排除。復(fù)習(xí)病理切片，明確腫瘤組織中各形態(tài)學(xué)亞型所占比例、脈管侵犯、壞死比例、STAS數(shù)目及形態(tài)。

1.2 方法手術(shù)切除標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，4 μm厚切片，行HE及免疫組化EnVision兩步法染色。一抗上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、vimentin及Snail分別購自北京中杉金橋公司、Abcam、Dako及CST公司；二抗購自北京中杉金橋公司；陰性對照采用PBS代替一抗。

1.3 結(jié)果判斷根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率進(jìn)行判斷[5-7]。(1)按陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評分：無著色為0分，弱著色為1分，中等著色為2分，強(qiáng)著色為3分。(2)按陽性細(xì)胞百分率評分：無陽性細(xì)胞為0分，1%～50%為1分，>50%為2分。兩項(xiàng)得分相加，其中≥4分為陽性，<4分為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用χ2檢驗(yàn)及Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析STAS與臨床病理特征的相關(guān)性。應(yīng)用Kaplan-Meier法及Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析總生存率及無復(fù)發(fā)生存率的影響因素。配對χ2檢驗(yàn)EMT相關(guān)蛋白在腫瘤主體與腫瘤邊緣、腫瘤邊緣與STAS表達(dá)的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ⅰ期肺腺癌中STAS與臨床病理特征的關(guān)系Ⅰ期肺腺癌412例，其中男性179例(43.4%)，女性233例(56.6%)，年齡33～83歲，中位年齡61歲。STAS陽性率為36.9%(152/412)，包括3種形態(tài)：微乳頭、實(shí)性細(xì)胞簇及單個(gè)細(xì)胞，不同形態(tài)STAS可混合出現(xiàn)。本組中有117例(77.0%)以微乳頭形態(tài)為主，33例(21.7%)以實(shí)性細(xì)胞簇為主，2例(1.3%)以單個(gè)細(xì)胞為主。

Ⅰ期肺腺癌中STAS與臨床病理特征相關(guān)性分析顯示，男性、有吸煙史、腫瘤直徑>2.5 cm、篩狀生長方式、壞死、脈管侵犯及胸膜侵犯與STAS的出現(xiàn)呈顯著相關(guān)(P<0.001，表1)。

表1 Ⅰ期肺腺癌中STAS與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

不同組織學(xué)亞型的STAS陽性率：微乳頭型及實(shí)體型肺腺癌STAS陽性率分別為86.7%、62.2%，高于腺泡型及乳頭型(分別為33.5%、37.9%)，貼壁型生長方式為主的病例中未發(fā)現(xiàn)STAS現(xiàn)象。進(jìn)一步將肺腺癌按微乳頭(micorpapillary, MIP)和實(shí)體(solid, SOL)成分的有無(比例超過5%)分為四種類型，即MIP-/SOL-、MIP-/SOL+、MIP+/SOL-和MIP+/SOL+，則STAS陽性率在上述四種類型中呈遞增趨勢(分別為10.3%、47.8%、62.7%、76.9%)。

2.2 STAS與EMT相關(guān)蛋白的關(guān)系采用免疫組化法檢測52例STAS陽性肺腺癌腫瘤中央及腫瘤邊緣EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin、N-cadherin、vimentin)及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)，比較4個(gè)標(biāo)志物在腫瘤不同部位陽性程度及比例。結(jié)果顯示：自腫瘤中央到邊緣，E-cadherin表達(dá)減弱，N-cadherin、vimentin及Snail表達(dá)增強(qiáng)(表2，圖1)。

圖1 肺腺癌的腫瘤中央及腫瘤邊緣中EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，自腫瘤中央到腫瘤邊緣，E-cadherin表達(dá)減弱，N-cadherin、vimentin及Snail表達(dá)增強(qiáng)，EnVision兩步法

表2 腫瘤主體、腫瘤邊緣及STAS中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)差異性分析

2.3 STAS與Ⅰ期肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系412例患者生存時(shí)間為7～60個(gè)月，平均57個(gè)月，中位隨訪時(shí)間37個(gè)月。STAS陽性組5年生存率低于陰性組，分別為75.2%和89.8%。男性患者、年齡≥65歲、腫瘤直徑>2.5 cm、有微乳頭成分、壞死、脈管侵犯及STAS陽性是影響患者總生存期的危險(xiǎn)因素，其中STAS陽性、年齡≥65歲、腫瘤直徑>2.5 cm是影響患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(危險(xiǎn)比分別為2.715、2.626、2.659，表3)。

表3 412例Ⅰ期肺腺癌患者總生存率的影響因素分析

412例患者中有48例(11.7%)腫瘤復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移部位主要有同/對側(cè)肺、同/對側(cè)縱隔淋巴結(jié)、同側(cè)鎖骨上淋巴結(jié)、胸膜、肝臟、腦、腎上腺及骨，復(fù)發(fā)時(shí)間為術(shù)后3～60個(gè)月，平均29.6個(gè)月，復(fù)發(fā)患者中31例(64.6%)有STAS。根據(jù)生存分析顯示STAS陽性組平均存活時(shí)間為(50.4±1.5)個(gè)月，STAS陰性組平均存活時(shí)間為(56.4±0.7)個(gè)月。Kaplan-Meier曲線分析顯示，STAS陰性組5年無復(fù)發(fā)生存率為83.1%，STAS陽性組則顯著下降，為66.6%(圖2A)。STAS陽性組與陰性組相比，復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯升高，術(shù)后第5年復(fù)發(fā)或死亡累積風(fēng)險(xiǎn)分別為40.8%和18.0%(圖2B)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。STAS陽性、腫瘤大小、有微乳頭成分及胸膜侵犯是腫瘤復(fù)發(fā)的顯著危險(xiǎn)因素，其中，STAS陽性是影響無復(fù)發(fā)生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(危險(xiǎn)比1.881)。

圖2 STAS與Ⅰ期肺腺癌患者預(yù)后相關(guān)性：A. 無復(fù)發(fā)生存率；B. 復(fù)發(fā)/死亡累積風(fēng)險(xiǎn)率

3 討論

肺癌主要包括腺癌、鱗癌及小細(xì)胞癌三種亞型，其中以腺癌最為常見，占原發(fā)性肺癌的比例超過40%[2]。肺腺癌主要包括5種組織學(xué)形態(tài)，即貼壁型、腺泡型、乳頭型、微乳頭型及實(shí)體型，研究發(fā)現(xiàn)微乳頭型及實(shí)體型肺腺癌更易發(fā)生STAS；不同分期肺腺癌STAS陽性率為30.3%～73%；STAS與肺腺癌預(yù)后密切相關(guān)，是腫瘤復(fù)發(fā)及患者總生存率的獨(dú)立影響因素，尤其對早期患者楔形或肺段切除術(shù)后的局部復(fù)發(fā)有顯著影響[3,8-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ⅰ期肺腺癌STAS陽性率為36.9%，微乳頭型及實(shí)體型肺腺癌STAS陽性率分別為86.7%、62.2%，顯著高于其他組織學(xué)類型。

STAS也可出現(xiàn)在肺癌其他組織學(xué)亞型，研究發(fā)現(xiàn)肺鱗癌及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中STAS陽性率分別為30%、26%，且STAS與肺鱗癌及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及肺癌相關(guān)死亡顯著相關(guān)，是肺鱗癌、小細(xì)胞肺癌及大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌的獨(dú)立預(yù)后因素[10-11]。

STAS引起眾多學(xué)者廣泛關(guān)注，其形成機(jī)制尚未闡明。STAS是以單個(gè)或小簇細(xì)胞的形式游離于腫瘤主體以外的肺泡腔，是腫瘤向周圍間質(zhì)浸潤的形式，與腫瘤出芽(tumor budding, TB)極為相似。研究表明，TB與Snail、Twist等轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)，伴有E-cadherin表達(dá)缺失及N-cadherin、vimentin等表達(dá)上調(diào)，其形成的主要機(jī)制是EMT的發(fā)生[12-13]。EMT是指具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有移動(dòng)能力的間質(zhì)細(xì)胞過程，主要由Snail等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，導(dǎo)致一系列主要標(biāo)志物的表達(dá)和(或)胞內(nèi)定位的改變[14]。由此我們推測肺腺癌STAS的形成可能與腫瘤自中央到邊緣發(fā)生EMT相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自腫瘤中央到腫瘤邊緣再到周圍STAS，E-cadherin表達(dá)依次減弱，N-cadherin及vimentin的表達(dá)在腫瘤邊緣和STAS之間無明顯差異，但均顯著高于腫瘤中央；Snail在腫瘤邊緣及STAS中表達(dá)上調(diào)。初步證實(shí)STAS的形成伴隨腫瘤細(xì)胞自中央到邊緣發(fā)生EMT的改變。由此推測，腫瘤EMT導(dǎo)致細(xì)胞黏附性降低、遷移力增強(qiáng)，可能是STAS形成的直接原因。

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是多階段、多基因參與的復(fù)雜過程，是腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境相互作用的結(jié)果，EMT是這一復(fù)雜過程的起始步驟。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)分析Ⅰ期肺腺癌STAS的臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)性，并初步證實(shí)STAS的形成伴隨腫瘤細(xì)胞EMT改變?，F(xiàn)階段STAS細(xì)胞簇如何在周圍肺泡腔獲得營養(yǎng)并逃避免疫細(xì)胞的攻擊，尚需進(jìn)一步探討。