王 亞，牛林軍，陸 軍，曹 威，邵玉寶，鮑蘭馨，陳曉宇

結直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，2018年我國結直腸癌的發(fā)病率、病死率均高于全球平均水平[1]。由于結直腸癌無典型的早期臨床癥狀，且缺乏完善的篩查系統(tǒng)，結直腸癌患者確診時多數(shù)已為晚期，較難獲得根治[2]。因此，尋找有特異性診斷價值的腫瘤標志物對結直腸癌患者預后和治療至關重要[3]。SKA3位于人第13q號染色體上，參與紡錘體和著絲粒形成，調(diào)節(jié)有絲分裂以及調(diào)控細胞增殖和凋亡[4]。據(jù)文獻報道[5]，SKA3蛋白在結腸癌、乳腺癌和前列腺癌等惡性腫瘤中高表達，并在其發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。研究表明，在腫瘤進展中常伴PI3K/AKT信號通路的改變[6]。有學者提出，PI3K/AKT信號通路的異常激活與結直腸癌的進展有關[7]。本實驗采用免疫組化法檢測SKA3在結直腸癌中的表達，探討轉染SKA3-siRNA干擾后對結直腸癌細胞SW480增殖、遷徙的影響及PI3K/AKT信號通路中的作用，為發(fā)現(xiàn)新的結直腸癌有效藥物干預靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年1月～2019年12月安徽省淮北市人民醫(yī)院行外科手術的69例結直腸癌與對應癌旁組織，患者術前均未接受放、化療和靶向治療等，術后均明確診斷為結直腸癌。本實驗經(jīng)安徽省淮北市人民醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與設備siRNA購自上海吉凱基因公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶，均購自美國Hyclone公司。BCA蛋白濃度測量試劑盒、Lipofectamin 2000，均購自Thermo Scientific公司。一抗羊抗人單克隆抗體SKA3、GAPDH，購自美國Abcam公司。一抗為羊源多克隆抗體AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K，均購自美國Cell Signaling Technology公司。免疫組化二抗辣根過氧化物酶標記兔抗羊IgG和DAB顯色試劑盒，購自北京中杉金橋公司。四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購自上海碧云天生物公司，Western blot試劑盒購自上海聯(lián)邁生物公司。其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 結直腸癌及其癌旁組織蠟塊標本4 μm厚切片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后經(jīng)微波抗原修復，山羊血清封閉。采用免疫組化SP法染色，滴加一抗羊抗人SKA3(1 ∶200)，4 ℃冰箱孵育過夜。加二抗兔抗羊(1 ∶400)，室溫孵育1 h；DAB顯色，蘇木精復染細胞核，二甲苯透明，中性樹脂封固。免疫組化陽性染色判斷參考文獻[6]：(1)按陽性細胞染色強度評分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按陽性細胞百分比評分：無陽性細胞為0分，陽性細胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。兩項得分結果相乘：0～4分為陰性，4～12分為陽性。

1.3.2結直腸癌SW480細胞培養(yǎng)、轉染 結直腸癌SW480細胞采用含10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)含1%青霉素和鏈霉素，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2飽和度濕度培養(yǎng)箱中。待細胞增殖至70%～80%融合率時，用0.25%胰酶消化傳代，通常2～3天傳代1次。取對數(shù)生長期的細胞進行轉染，嚴格按脂質(zhì)體轉染試劑Lipofectamine 2000及基因片段說明書進行SKA3-siRNA轉染操作，SKA3-siRNA序列為AATGAAGTTAAGGTCCCTT，由上海吉瑪生物公司合成。用10 μL Lipofectamine 2000混合4 μg基因片段，未進行轉染處理的SW480細胞為對照組。置500 μL無血清的DMEM培養(yǎng)基中靜置20 min，加入終濃度為1 μg/L培養(yǎng)皿轉染6 h后，用含10%胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h作為轉染組。采用熒光倒置顯微鏡和Western blot法觀察SKA3-siRNA轉染SW480細胞效果。

1.3.3MTT法和克隆形成實驗 采用MTT細胞增殖試劑盒進行增殖活力檢測，取SKA3-siRNA轉染SW480細胞和未轉染的細胞，按照密度為5.0×104/L SW480細胞接種每孔100 μL于96孔板，每組5個復孔，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h。將培養(yǎng)板取出后，吸棄上清液，加入二甲基亞砜每孔150 μL，置搖床避光混勻反應10 min，使沉淀完全溶解，酶標儀測定490 nm波長處的吸光度值(optical density, OD)，反映細胞增殖能力，實驗重復3次。取上述兩組對數(shù)生長期(2×104/mL)細胞懸液，分別接種于培養(yǎng)皿中，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周后，棄上清液，經(jīng)4%多聚甲醛固定，Giemsa染液染色20 min，觀察克隆形成情況，重復實驗3次。

1.3.4細胞遷徙實驗 將濃度為1.0×107/L的SW480及SKA3-siRNA轉染的SW480分別接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，沿6孔板中線位置，使用微量吸管槍頭在結直腸癌SW480細胞表面劃痕，PBS漂洗消除細胞殘渣，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進行觀察與拍照，重復實驗3次。計算兩組細胞劃痕愈合率，細胞劃痕愈合率(%)=(初始劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%。

1.3.5Western blot法 使用RIPA裂解液將SW480及SKA3-siRNA轉染的SW480細胞冰上裂解30 min，低溫離心機15 000 r/min離心10 min，收集上清液；采用BCA法測量蛋白質(zhì)濃度，行SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)，再轉印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上；將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中封閉2 h，然后分別與羊源多克隆一抗PI3K(1 ∶1 500)、p-PI3K(1 ∶1 500)、AKT(1 ∶2 000)、p-AKT(1 ∶2 000)及GAPDH(1 ∶3 000)，4 ℃孵育過夜，次日加兔抗羊二抗(1 ∶2 000)，室溫孵育1 h；ECL化學發(fā)光顯影液、曝光約3 min，應用Imagine J軟件對條帶進行顯影分析，重復實驗3次。

2 結果

2.1 結直腸癌中SKA3蛋白的表達SKA3陽性定位于結直腸腺上皮和黏膜上皮細胞胞質(zhì)中，SKA3蛋白陽性呈棕色或棕褐色(圖1)。69例結直腸癌組織中SKA3蛋白的陽性率為82.26%，在癌旁組織中陽性率為25.81%，兩組相比差異有顯著性(χ2=41.862，P<0.01)。

圖1 SKA3蛋白在不同結直腸組織中的表達：A.癌旁組織中呈陰性；B.結直腸癌組織中呈陽性，SP法

2.2 結直腸癌中SKA3蛋白表達與臨床病理特征的關系統(tǒng)計結果表明，SKA3蛋白在結直腸癌中的表達與患者年齡(P=0.834)、性別(P=0.894)、腫瘤直徑(P=0.919)、組織學類型(P=0.980)均無關；與結直腸癌分化程度(P=0.011)、浸潤程度(P=0.023)、淋巴結轉移(P=0.014)均有關(表1)。

表1 結直腸癌中SKA3蛋白表達與臨床病理特征的關系

2.3 細胞轉染效果采用細胞免疫熒光化學和Western blot法觀察SKA3-siRNA轉染SW480細胞的效果：細胞免疫熒光化學觀察顯示，SW480細胞中SKA3蛋白呈綠色熒光，與對照組比較，SKA3-siRNA轉染組的SW480細胞中SKA3蛋白表達水平降低(圖2)。Western blot顯示，SKA3-siRNA轉染組的SW480細胞中SKA3蛋白表達比對照組明顯下降(P<0.05，圖3)。

圖2 細胞免疫熒光化學顯示SKA3蛋白在結直腸癌SW480細胞中的表達：A.對照組；B.SKA3-siRNA轉染組

圖3 Western blot法檢測SKA3蛋白在結直腸癌SW480細胞中的表達：A.Western blot法檢測；B.半定量統(tǒng)計學分析(n=3)，與對照組比較，*P<0.05

2.4 SKA3-siRNA轉染后結直腸癌SW480細胞增殖的影響MTT法檢測結果表明，培養(yǎng)72 h，轉染SKA3-siRNA的結直腸癌SW480細胞OD490值明顯降低(P<0.05，圖4)?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示，siRNA-SKA3轉染組比對照組的結直腸癌SW480細胞克隆形成胞數(shù)目明顯減少(圖5)。上述結果表明，結直腸癌SW480細胞株敲減SKA3的表達后，顯著抑制了癌細胞的生長速度及細胞活性。

圖4 MTT法檢測SKA3-siRNA后結直腸癌SW480細胞的增殖(n=3)：與對照組比較，*P<0.05

圖5 結直腸癌SW480細胞中SKA3-siRNA后表達克隆形成實驗：A.對照組；B.SKA3-siRNA轉染組

2.5 SKA3-siRNA轉染后結直腸癌SW480細胞遷徙能力的影響劃痕實驗結果顯示，24 h后SKA3-siRNA轉染組中結直腸癌SW480細胞比對照組作用劃痕寬度明顯增大。本組結果還顯示對照組SW480細胞劃痕愈合率為(68.7±4.9)%，SKA3-siRNA轉染組結直腸癌SW480細胞劃痕愈合率為(27.5±4.2)%，兩組相比差異有顯著性(t=5.362，P=0.018，圖6)。

圖6 SKA3-siRNA轉染24 h后對結直腸癌SW480細胞劃痕實驗的影響：A.細胞爬片；B.柱狀分析圖，與對照組比較，**P<0.01

2.6 PI3K/AKT信號通路在SKA3-siRNA轉染后對結直腸癌SW480細胞表達的影響采用Western blot法檢測PI3K/AKT信號通路在SKA3-siRNA轉染結直腸癌SW480細胞中的表達改變，結果顯示，轉染組與對照組相比，PI3K、AKT蛋白水平改變差異無顯著性，而p-PI3K、p-AKT蛋白水平明顯下降(P<0.05，圖7)。

圖7 Western blot法檢測SKA3-siRNA轉染后對結直腸癌SW480細胞PI3K/AKT信號通路的影響：A.Western blot法檢測；B.半定量統(tǒng)計學分析(n=3)；與對照組比較，*P<0.05

3 討論

結直腸癌是臨床較為常見的惡性腫瘤，手術治療仍是結直腸癌的治療主要方式，手術前、后聯(lián)合放、化療對提高患者生存時間和生存質(zhì)量有一定幫助，但部分患者早期即發(fā)生遠處轉移，故早期發(fā)現(xiàn)和確診結直腸癌或發(fā)現(xiàn)敏感藥物治療靶點對治療至關重要[8]。然而，現(xiàn)有的檢測、篩查手段如腸鏡檢查是侵入性病理取材，患者檢查的依從性不夠，故迫切需要發(fā)現(xiàn)某些生物學標志物和治療靶點，以提高結直腸癌患者早期診斷和治療效果[9]。SKA3為哺乳動物減數(shù)分裂紡錘體遷移和后期定位的關鍵，過表達SKA3與腎癌[10]、乳腺癌[11]、甲狀腺乳頭狀癌[12]、肝癌[13]和喉鱗狀上皮癌[14]等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。已有研究表明，SKA3異常表達可以促進乳腺癌細胞增殖、轉移[15]；SKA3是子宮頸癌的分子標志物，在子宮頸癌患者中高表達[16]。目前，SKA3在結直腸癌中的作用尚未明確，本組發(fā)現(xiàn)癌旁正常結直腸組織中SKA3的表達明顯低于結直腸癌組織中，且SKA3蛋白表達與腫瘤浸潤深度、淋巴轉移有關，提示SKA3表達參與結直腸癌患者預后。SKA3有可能成為結直腸癌的預后標志物，檢測SKA3蛋白含量有助于判斷結直腸癌的惡性程度和進展狀態(tài)。

體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，SKA3在肝癌細胞中高表達，且SKA3過表達時，肝癌細胞增殖增強，凋亡減弱，而干擾SKA3表達后，肝癌細胞增殖降低[17]。Ruan等[18]發(fā)現(xiàn)SKA3在乳腺癌Bca細胞系中表達升高，利用siRNA干擾技術特異性地敲除乳腺癌Bca細胞系中SKA3的表達，采用CCK-8和集落形成實驗確定干擾SKA3表達具有體外抗癌作用，證實SKA3有望成為對抗乳腺癌潛在靶點。我們的試驗結果也表明，通過SKA3-siRNA轉染干擾技術，敲減SKA3在結直腸癌細胞SW480中的表達，可顯著抑制SW480細胞的增殖、遷徙能力。

生物細胞中普遍存在PI3K/AKT信號通路，調(diào)節(jié)細胞生長、分化、凋亡和葡萄糖轉運等，與腫瘤、炎癥等疾病的發(fā)生緊密相關。過度激活PI3K/AKT信號通路與細胞產(chǎn)生的耐藥性密切相關[19]。在乳腺癌中該通路激活與內(nèi)分泌抵抗和較差的預后有關，聯(lián)合使用PI3K/AKT信號通路抑制劑，增強化療藥物療效明顯增加[20]。Hu等[21]研究發(fā)現(xiàn)，SKA3在肺腺癌中過表達與淋巴結轉移和不良預后相關，其機制可能與SKA3結合并激活表皮生長因子受體進而激活PI3K/AKT信號通路有關。本實驗通過Western blot法進一步檢測PI3K/AKT信號通路蛋白，發(fā)現(xiàn)敲減SKA3的結直腸癌細胞SW480中p-AKT、p-PI3K蛋白水平顯著下降。p-AKT、p-PI3K蛋白是PI3K/AKT信號通路的關鍵分子，因此我們認為敲減SKA3可能通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制結直腸癌細胞增殖。

綜上所述，SKA3在結直腸癌組織中高表達，其表達強弱與結直腸癌的臨床病理學特征具有相關性，SKA3高表達預示結直腸癌患者的不良預后；敲減SKA3表達，可抑制結直腸癌SW480細胞的增殖和遷徙，其機制可能與抑制PI3K/AKT信號通路有關。因此，監(jiān)測SKA3表達可能為結直腸癌的臨床診療及預后評估提供重要的參考價值。