王 亞，牛林軍，陸 軍，曹 威，邵玉寶，鮑蘭馨，陳曉宇

結(jié)直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，2018年我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率、病死率均高于全球平均水平[1]。由于結(jié)直腸癌無典型的早期臨床癥狀，且缺乏完善的篩查系統(tǒng)，結(jié)直腸癌患者確診時多數(shù)已為晚期，較難獲得根治[2]。因此，尋找有特異性診斷價值的腫瘤標(biāo)志物對結(jié)直腸癌患者預(yù)后和治療至關(guān)重要[3]。SKA3位于人第13q號染色體上，參與紡錘體和著絲粒形成，調(diào)節(jié)有絲分裂以及調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡[4]。據(jù)文獻(xiàn)報道[5]，SKA3蛋白在結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，并在其發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。研究表明，在腫瘤進(jìn)展中常伴PI3K/AKT信號通路的改變[6]。有學(xué)者提出，PI3K/AKT信號通路的異常激活與結(jié)直腸癌的進(jìn)展有關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測SKA3在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，探討轉(zhuǎn)染SKA3-siRNA干擾后對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480增殖、遷徙的影響及PI3K/AKT信號通路中的作用，為發(fā)現(xiàn)新的結(jié)直腸癌有效藥物干預(yù)靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年1月～2019年12月安徽省淮北市人民醫(yī)院行外科手術(shù)的69例結(jié)直腸癌與對應(yīng)癌旁組織，患者術(shù)前均未接受放、化療和靶向治療等，術(shù)后均明確診斷為結(jié)直腸癌。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽省淮北市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與設(shè)備siRNA購自上海吉凱基因公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶，均購自美國Hyclone公司。BCA蛋白濃度測量試劑盒、Lipofectamin 2000，均購自Thermo Scientific公司。一抗羊抗人單克隆抗體SKA3、GAPDH，購自美國Abcam公司。一抗為羊源多克隆抗體AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K，均購自美國Cell Signaling Technology公司。免疫組化二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG和DAB顯色試劑盒，購自北京中杉金橋公司。四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購自上海碧云天生物公司，Western blot試劑盒購自上海聯(lián)邁生物公司。其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 結(jié)直腸癌及其癌旁組織蠟塊標(biāo)本4 μm厚切片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后經(jīng)微波抗原修復(fù)，山羊血清封閉。采用免疫組化SP法染色，滴加一抗羊抗人SKA3(1 ∶200)，4 ℃冰箱孵育過夜。加二抗兔抗羊(1 ∶400)，室溫孵育1 h；DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，二甲苯透明，中性樹脂封固。免疫組化陽性染色判斷參考文獻(xiàn)[6]：(1)按陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按陽性細(xì)胞百分比評分：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～4分為陰性，4～12分為陽性。

1.3.2結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染 結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞采用含10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)含1%青霉素和鏈霉素，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2飽和度濕度培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞增殖至70%～80%融合率時，用0.25%胰酶消化傳代，通常2～3天傳代1次。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，嚴(yán)格按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000及基因片段說明書進(jìn)行SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染操作，SKA3-siRNA序列為AATGAAGTTAAGGTCCCTT，由上海吉瑪生物公司合成。用10 μL Lipofectamine 2000混合4 μg基因片段，未進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理的SW480細(xì)胞為對照組。置500 μL無血清的DMEM培養(yǎng)基中靜置20 min，加入終濃度為1 μg/L培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)染6 h后，用含10%胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h作為轉(zhuǎn)染組。采用熒光倒置顯微鏡和Western blot法觀察SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞效果。

1.3.3MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn) 采用MTT細(xì)胞增殖試劑盒進(jìn)行增殖活力檢測，取SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，按照密度為5.0×104/L SW480細(xì)胞接種每孔100 μL于96孔板，每組5個復(fù)孔，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h。將培養(yǎng)板取出后，吸棄上清液，加入二甲基亞砜每孔150 μL，置搖床避光混勻反應(yīng)10 min，使沉淀完全溶解，酶標(biāo)儀測定490 nm波長處的吸光度值(optical density, OD)，反映細(xì)胞增殖能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。取上述兩組對數(shù)生長期(2×104/mL)細(xì)胞懸液，分別接種于培養(yǎng)皿中，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周后，棄上清液，經(jīng)4%多聚甲醛固定，Giemsa染液染色20 min，觀察克隆形成情況，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.4細(xì)胞遷徙實(shí)驗(yàn) 將濃度為1.0×107/L的SW480及SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染的SW480分別接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，沿6孔板中線位置，使用微量吸管槍頭在結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞表面劃痕，PBS漂洗消除細(xì)胞殘渣，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行觀察與拍照，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。計算兩組細(xì)胞劃痕愈合率，細(xì)胞劃痕愈合率(%)=(初始劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%。

1.3.5Western blot法 使用RIPA裂解液將SW480及SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞冰上裂解30 min，低溫離心機(jī)15 000 r/min離心10 min，收集上清液；采用BCA法測量蛋白質(zhì)濃度，行SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)，再轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上；將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中封閉2 h，然后分別與羊源多克隆一抗PI3K(1 ∶1 500)、p-PI3K(1 ∶1 500)、AKT(1 ∶2 000)、p-AKT(1 ∶2 000)及GAPDH(1 ∶3 000)，4 ℃孵育過夜，次日加兔抗羊二抗(1 ∶2 000)，室溫孵育1 h；ECL化學(xué)發(fā)光顯影液、曝光約3 min，應(yīng)用Imagine J軟件對條帶進(jìn)行顯影分析，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌中SKA3蛋白的表達(dá)SKA3陽性定位于結(jié)直腸腺上皮和黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)中，SKA3蛋白陽性呈棕色或棕褐色(圖1)。69例結(jié)直腸癌組織中SKA3蛋白的陽性率為82.26%，在癌旁組織中陽性率為25.81%，兩組相比差異有顯著性(χ2=41.862，P<0.01)。

圖1 SKA3蛋白在不同結(jié)直腸組織中的表達(dá)：A.癌旁組織中呈陰性；B.結(jié)直腸癌組織中呈陽性，SP法

2.2 結(jié)直腸癌中SKA3蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系統(tǒng)計結(jié)果表明，SKA3蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與患者年齡(P=0.834)、性別(P=0.894)、腫瘤直徑(P=0.919)、組織學(xué)類型(P=0.980)均無關(guān)；與結(jié)直腸癌分化程度(P=0.011)、浸潤程度(P=0.023)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.014)均有關(guān)(表1)。

表1 結(jié)直腸癌中SKA3蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果采用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)和Western blot法觀察SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞的效果：細(xì)胞免疫熒光化學(xué)觀察顯示，SW480細(xì)胞中SKA3蛋白呈綠色熒光，與對照組比較，SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染組的SW480細(xì)胞中SKA3蛋白表達(dá)水平降低(圖2)。Western blot顯示，SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染組的SW480細(xì)胞中SKA3蛋白表達(dá)比對照組明顯下降(P<0.05，圖3)。

圖2 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)顯示SKA3蛋白在結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中的表達(dá)：A.對照組；B.SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染組

圖3 Western blot法檢測SKA3蛋白在結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中的表達(dá)：A.Western blot法檢測；B.半定量統(tǒng)計學(xué)分析(n=3)，與對照組比較，*P<0.05

2.4 SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染后結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖的影響MTT法檢測結(jié)果表明，培養(yǎng)72 h，轉(zhuǎn)染SKA3-siRNA的結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞OD490值明顯降低(P<0.05，圖4)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA-SKA3轉(zhuǎn)染組比對照組的結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞克隆形成胞數(shù)目明顯減少(圖5)。上述結(jié)果表明，結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株敲減SKA3的表達(dá)后，顯著抑制了癌細(xì)胞的生長速度及細(xì)胞活性。

圖4 MTT法檢測SKA3-siRNA后結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的增殖(n=3)：與對照組比較，*P<0.05

圖5 結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中SKA3-siRNA后表達(dá)克隆形成實(shí)驗(yàn)：A.對照組；B.SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染組

2.5 SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染后結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞遷徙能力的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24 h后SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染組中結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞比對照組作用劃痕寬度明顯增大。本組結(jié)果還顯示對照組SW480細(xì)胞劃痕愈合率為(68.7±4.9)%，SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染組結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞劃痕愈合率為(27.5±4.2)%，兩組相比差異有顯著性(t=5.362，P=0.018，圖6)。

圖6 SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染24 h后對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的影響：A.細(xì)胞爬片；B.柱狀分析圖，與對照組比較，**P<0.01

2.6 PI3K/AKT信號通路在SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染后對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞表達(dá)的影響采用Western blot法檢測PI3K/AKT信號通路在SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中的表達(dá)改變，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組與對照組相比，PI3K、AKT蛋白水平改變差異無顯著性，而p-PI3K、p-AKT蛋白水平明顯下降(P<0.05，圖7)。

圖7 Western blot法檢測SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染后對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞PI3K/AKT信號通路的影響：A.Western blot法檢測；B.半定量統(tǒng)計學(xué)分析(n=3)；與對照組比較，*P<0.05

3 討論

結(jié)直腸癌是臨床較為常見的惡性腫瘤，手術(shù)治療仍是結(jié)直腸癌的治療主要方式，手術(shù)前、后聯(lián)合放、化療對提高患者生存時間和生存質(zhì)量有一定幫助，但部分患者早期即發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，故早期發(fā)現(xiàn)和確診結(jié)直腸癌或發(fā)現(xiàn)敏感藥物治療靶點(diǎn)對治療至關(guān)重要[8]。然而，現(xiàn)有的檢測、篩查手段如腸鏡檢查是侵入性病理取材，患者檢查的依從性不夠，故迫切需要發(fā)現(xiàn)某些生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，以提高結(jié)直腸癌患者早期診斷和治療效果[9]。SKA3為哺乳動物減數(shù)分裂紡錘體遷移和后期定位的關(guān)鍵，過表達(dá)SKA3與腎癌[10]、乳腺癌[11]、甲狀腺乳頭狀癌[12]、肝癌[13]和喉鱗狀上皮癌[14]等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。已有研究表明，SKA3異常表達(dá)可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移[15]；SKA3是子宮頸癌的分子標(biāo)志物，在子宮頸癌患者中高表達(dá)[16]。目前，SKA3在結(jié)直腸癌中的作用尚未明確，本組發(fā)現(xiàn)癌旁正常結(jié)直腸組織中SKA3的表達(dá)明顯低于結(jié)直腸癌組織中，且SKA3蛋白表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示SKA3表達(dá)參與結(jié)直腸癌患者預(yù)后。SKA3有可能成為結(jié)直腸癌的預(yù)后標(biāo)志物，檢測SKA3蛋白含量有助于判斷結(jié)直腸癌的惡性程度和進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。

體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，SKA3在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，且SKA3過表達(dá)時，肝癌細(xì)胞增殖增強(qiáng)，凋亡減弱，而干擾SKA3表達(dá)后，肝癌細(xì)胞增殖降低[17]。Ruan等[18]發(fā)現(xiàn)SKA3在乳腺癌Bca細(xì)胞系中表達(dá)升高，利用siRNA干擾技術(shù)特異性地敲除乳腺癌Bca細(xì)胞系中SKA3的表達(dá)，采用CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)確定干擾SKA3表達(dá)具有體外抗癌作用，證實(shí)SKA3有望成為對抗乳腺癌潛在靶點(diǎn)。我們的試驗(yàn)結(jié)果也表明，通過SKA3-siRNA轉(zhuǎn)染干擾技術(shù)，敲減SKA3在結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中的表達(dá)，可顯著抑制SW480細(xì)胞的增殖、遷徙能力。

生物細(xì)胞中普遍存在PI3K/AKT信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等，與腫瘤、炎癥等疾病的發(fā)生緊密相關(guān)。過度激活PI3K/AKT信號通路與細(xì)胞產(chǎn)生的耐藥性密切相關(guān)[19]。在乳腺癌中該通路激活與內(nèi)分泌抵抗和較差的預(yù)后有關(guān)，聯(lián)合使用PI3K/AKT信號通路抑制劑，增強(qiáng)化療藥物療效明顯增加[20]。Hu等[21]研究發(fā)現(xiàn)，SKA3在肺腺癌中過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)，其機(jī)制可能與SKA3結(jié)合并激活表皮生長因子受體進(jìn)而激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot法進(jìn)一步檢測PI3K/AKT信號通路蛋白，發(fā)現(xiàn)敲減SKA3的結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中p-AKT、p-PI3K蛋白水平顯著下降。p-AKT、p-PI3K蛋白是PI3K/AKT信號通路的關(guān)鍵分子，因此我們認(rèn)為敲減SKA3可能通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。

綜上所述，SKA3在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)弱與結(jié)直腸癌的臨床病理學(xué)特征具有相關(guān)性，SKA3高表達(dá)預(yù)示結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后；敲減SKA3表達(dá)，可抑制結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的增殖和遷徙，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT信號通路有關(guān)。因此，監(jiān)測SKA3表達(dá)可能為結(jié)直腸癌的臨床診療及預(yù)后評估提供重要的參考價值。