門娟娟

（山東省高密市醴泉街道畜牧獸醫(yī)站 261512）

豬流行性腹瀉主要是豬流行性腹瀉病毒導(dǎo)致的一種豬腸道傳染病，此病可使豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉及脫水癥狀，近年來，隨著我國豬養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模逐漸擴大，此傳染病的發(fā)病率有所上升。其癥狀表現(xiàn)、流行病學(xué)、病毒形態(tài)學(xué)及病理變化等方面與豬傳染性胃腸炎非常相像，所以對豬流行性腹瀉的診斷存在一定難度，需要通過實驗室檢驗的方式對病豬進行檢查，從而科學(xué)的進行豬流行性腹瀉診斷，為病豬有效治療提供依據(jù)。

1 免疫熒光法概述

1.1 概念

免疫熒光法主要是將免疫學(xué)法同熒光標記技術(shù)相結(jié)合來對特異蛋白抗原在細胞內(nèi)部中的分布進行研究的一種檢測方法。因熒光素能發(fā)出熒光，并且在熒光顯微鏡下能被檢出，所以可以對抗原實施細胞定位，通過免疫熒光技術(shù)對細胞或者說細胞組織內(nèi)部的抗原及半抗原物質(zhì)顯示和檢查，故稱之為免疫熒光細胞化學(xué)技術(shù)。

1.2 應(yīng)用方法

本次主要是觀察免疫熒光法診斷豬流行性腹瀉的效果，所以選取的檢驗對象應(yīng)為病豬，需要對病豬實施解剖操作，并取部分小腸，將其作為冰凍切片，也可以選取小腸黏膜進行抹片，然后將獲取的標本防治在自然環(huán)境之中自然風(fēng)干，完成風(fēng)干操作后需要通過丙酮對其實施固定，然后將熒光抗體加入完成染色操作，染色程序如下。

（1)標準養(yǎng)性抗原片以及陰性抗原片通過0.01MPBS（pH7.4)進行預(yù)濕。

（2)應(yīng)將被檢血清進行稀釋，并向涂片地價，然后放置37℃的恒溫盒之中感做30min。

（3)使用濃度為0.1%吐溫80的0.01MPBS（pH7.4)清洗4次，每次清洗持續(xù)10min，然后使用無離子水及PBS再次清洗，清洗次數(shù)各1次。

（4)滴加濃度為0.1%的伊文思藍溶液，將豬IgG熒光抗體進行稀釋，然后將其涂于標本上，并將其置放在37℃恒溫盒之中進行染色，染色持續(xù)時間為30min。

（5)使用0.01MPBS（pH7.4)清洗3次，清洗時間分別為3、5和8min，然后使用無離子水清洗1次。

（6)滴加碳酸緩沖甘油，并封片。

完成染色操作后需要對其全面水洗，水洗完成后需要對其封蓋進行鏡檢，并得出相應(yīng)的檢驗結(jié)果，除此之外，還應(yīng)對病豬進行電鏡檢查，從而同免疫熒光法的檢驗結(jié)果進行對比。

1.3 判定標準

可以采用熒光顯微鏡對涂片進行觀察，當(dāng)陰性血清和陽性血清與PBS對照之后均符合的情況下可以通過標準養(yǎng)性抗原片上面的腸絨毛上皮細胞胞漿內(nèi)部的熒光亮度進行判定，判定方法是觀察熒光亮度強弱。若熒光呈現(xiàn)閃亮綠色熒光的情況下，則可以將其判定為強陽性；若熒光呈現(xiàn)明亮及普通綠色，則可將其判定為陽性；若熒光呈現(xiàn)出比較弱的綠色，則可判定為弱陽性；若熒光呈現(xiàn)出微弱綠色，則可將其判定為疑似病例；若熒光呈現(xiàn)為紅色，則可將其判定為陰性。

2 案例分析

2.1 案例概況

某種豬養(yǎng)殖場共養(yǎng)殖種豬1263頭，在養(yǎng)殖的過程中發(fā)現(xiàn)個別種豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、食欲不振等癥狀，養(yǎng)殖場負責(zé)人張某立即采取隔離措施，將出現(xiàn)癥狀的種豬單獨隔離于隔離觀察區(qū)，并對病豬之前所處環(huán)境進行消毒。由于發(fā)現(xiàn)癥狀的78頭種豬之前與豬群混養(yǎng)，故需要做好相關(guān)的隔離措施。與此同時，張某因懷疑種豬患得豬流行性腹瀉，故立即向當(dāng)?shù)貏游餀z疫部門報告?zhèn)浒?，由?dāng)?shù)貏游餀z疫部門攜帶檢疫設(shè)備和試劑前來該養(yǎng)豬場進行檢疫工作。

2.2 診斷過程

養(yǎng)殖場負責(zé)人張某在養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)豬群中個別種豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、食欲不振、脫水等一系列癥狀，初步懷疑種豬患傳染性胃腸炎，為了避免傳染同圈的其他種豬，張某立即采取了隔離查看措施，2d后脫水種豬死亡，張某見狀立即向其所在地防疫部門說明情況，由上級部門委派專業(yè)防疫人員前往該養(yǎng)殖場參與檢疫工作，通過防疫人員根據(jù)種豬的臨床癥狀觀察，初步懷疑種豬患有流行性腹瀉或者是傳染性胃腸炎，為了對患病種豬進一步確診，對該豬場已死亡種豬共22例實施實驗室檢驗，所采用方法即免疫熒光法，檢測流程與上述方法內(nèi)容一致。最后將診斷結(jié)果與病理診斷進行對比。

2.3 檢測結(jié)果

此次采用免疫熒光法進行檢測，檢測的目標為豬流行性腹瀉病毒，通過全面的排查，得出的檢測結(jié)果如附表所示。

由附表可知，該種豬養(yǎng)殖場死亡病豬中陰性及疑似病例無，可見所有種豬均可能患有豬流行性腹瀉，對于22病死豬又進行了病例診斷，經(jīng)病理診斷得出確診病例為21例，免疫熒光法診斷準確率可達95.45%。此結(jié)果說明針對豬流行性腹瀉采取免疫熒光法進行診斷能獲取良好的診斷效果。

附表 種豬養(yǎng)殖場免疫熒光法檢測結(jié)果 單位：%

3 討論

豬流行性腹瀉是一種高發(fā)性傳染病，發(fā)病后主要癥狀為腹瀉，并且疫情傳播速度比較慢，在診斷方面容易與其他疾病之間混淆，尤其是豬養(yǎng)殖時容易出現(xiàn)的傳染性胃腸炎等病，兩種疾病的相似度比較高，所以在實際養(yǎng)殖過程中，若豬出現(xiàn)以上癥狀容易誤診，所以在對病豬診斷時，不應(yīng)僅依賴于病豬臨床癥狀和流行病學(xué)對其進行確診，還應(yīng)通過實驗室檢驗的方法提升診斷有效性和真實性[1]。

當(dāng)前針對豬流行性腹瀉的診斷手段很多，如病毒分離鑒定、微量血清中和試驗、電鏡檢查、免疫熒光法檢測等，這些方法已經(jīng)得到普及推廣的診斷方法是電鏡檢查和免疫熒光法，這兩種方法雖然在試驗操作嚴格性方面表現(xiàn)一般，但對操作人員的熟練度和專業(yè)度方面要求比較低，可以推廣。在兩種方法中，電鏡法的操作非常簡便，且可以獲取直觀的定性結(jié)果，但儀器設(shè)備價格方面比較昂貴，且檢測報告結(jié)果需要在3～7d內(nèi)才能形成，容易導(dǎo)致傳染病傳播蔓延。但免疫熒光法這種診斷方法則能在非常短的時間內(nèi)將相關(guān)檢測結(jié)果得出，并且不會與輪狀病毒、傳染性胃腸炎病毒、大腸桿菌及豬細小病毒等混淆，所以免疫熒光法檢測的結(jié)果更準確，在此次觀察試驗中，通過案例調(diào)查分析得出，該養(yǎng)殖場通過免疫熒光法共檢測陽性病例22例，通過病理診斷得出確診病豬共21例，準確率高達95.45%。說明免疫熒光法的診斷準確率非常高，適合在豬養(yǎng)殖場推廣使用[2]。

在此次觀察試驗中需要說明的是，免疫熒光法在操作過程中主要以病豬小腸等相關(guān)部位取樣當(dāng)作檢驗標本，所以免疫熒光法檢驗并不能在疾病初診階段全面應(yīng)用，但由于豬流行性腹瀉是一種傳染性疾病，需要病豬死亡后及時對病死豬進行檢查，從而如實反映其死因，更重要的是當(dāng)病豬出現(xiàn)癥狀后，需要養(yǎng)殖人員立即采取隔離措施，并加強監(jiān)控，以免造成疾病蔓延，同時，還需要根據(jù)免疫熒光法檢測結(jié)果對其他豬群作出有效的治療干預(yù)，以保證豬群安全，防止此病傳染蔓延。

總而言之，免疫熒光法在對豬流行性腹瀉診斷有突出效用，基于此病傳染性這一特點及免疫熒光法自身的優(yōu)勢，可將其在豬養(yǎng)殖方面全面推廣應(yīng)用，從而能及時、有效的保證疾病得到控制，促進養(yǎng)殖安全。