李子勇 曾曉寧 滿建魯 閆亮

(山東勝利生物工程有限公司 272000）

畜牧業(yè)作為農(nóng)業(yè)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)，為保障國(guó)家畜產(chǎn)品供給、增加農(nóng)牧民收入、改善居民生活水平做出重要貢獻(xiàn)。同時(shí)，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，有機(jī)畜牧業(yè)和綠色畜牧業(yè)的轉(zhuǎn)型升級(jí)，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)峻考驗(yàn)。國(guó)家高度重視畜牧業(yè)綠色發(fā)展和有機(jī)養(yǎng)殖，在動(dòng)物養(yǎng)殖過程中盡量使用有機(jī)飼料和無抗飼料，而飼料來源起決定性作用。在農(nóng)作物種植過程中，農(nóng)藥殘留是影響我國(guó)綠色發(fā)展和有機(jī)養(yǎng)殖的重要因素之一。多殺菌素是全球低毒農(nóng)藥的典型代表，同時(shí)也是世界上最具有發(fā)展前途的農(nóng)藥。作為一種安全性高，作用位點(diǎn)專一，低毒高效的典型的新型微生物藥物具有較好的發(fā)展前景。

多殺菌素(Spinosad,1)是由刺糖多孢菌合成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1]，分子中含有獨(dú)特的四環(huán)結(jié)構(gòu)，四環(huán)母核的9、17位上分別連接有L-鼠李糖和D-福樂糖胺。1類化合物中活性最高的兩個(gè)組分是spinosyn A和spinosyn D[2]，其他組分活性較弱。目前實(shí)驗(yàn)室流行的多殺菌素發(fā)酵工藝大多使用植物油或油酸甲酯作為產(chǎn)物合成的碳源，以提高多殺菌素的產(chǎn)量。馬坤等[3]研究發(fā)現(xiàn)，植物油對(duì)刺糖多孢菌生長(zhǎng)及其合成多殺菌素能力有比較明顯的影響。油酸甲酯和植物油成分類似，是一種不飽和脂肪酸酯，其在發(fā)酵液中利用率的高低是影響抗生素效價(jià)提高的關(guān)鍵[4]。由于油酸甲酯難溶于發(fā)酵液，濃度過高會(huì)影響發(fā)酵液中的溶氧，對(duì)微生物的生產(chǎn)代謝不利，最終會(huì)影響產(chǎn)物的合成。因此，多殺菌素發(fā)酵工藝一般在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加少量油酸甲酯，中間過程補(bǔ)入一定量的油酸甲酯，保證既能維持發(fā)酵液中油酸甲酯的濃度，又不會(huì)對(duì)菌絲生長(zhǎng)及多殺菌素的合成產(chǎn)生不利影響。王美玲等[5]研究發(fā)現(xiàn)，油脂的補(bǔ)加種類、濃度、時(shí)間會(huì)明顯影響抗生素的產(chǎn)量，所以深入研究油酸甲酯對(duì)發(fā)酵過程中微生物的生長(zhǎng)狀態(tài)及次級(jí)代謝的影響，確定最佳的補(bǔ)料周期和濃度，對(duì)多殺菌素的發(fā)酵工藝改進(jìn)具有重要的指導(dǎo)意義。鑒于此，本文通過基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中油酸甲酯替代淀粉和不同發(fā)酵周期添加不同濃度油酸甲酯對(duì)多殺菌素發(fā)酵合成影響的研究與探討，為工業(yè)化生產(chǎn)多殺菌素提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

原始菌種：刺糖多孢菌，保存于山東勝利生物工程有限公司菌種中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1.0%、酵母浸粉0.5%、瓊脂2.5%、脫脂奶粉0.5%、七水硫酸鎂0.1%。

種子瓶培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%、玉米淀粉1.5%、酵母粉2%、七水硫酸鎂0.25%。

發(fā)酵瓶培養(yǎng)基：葡萄糖4%、玉米淀粉6%、棉籽餅粉2%、酵母粉0.8%、麩質(zhì)粉0.6%、蛋白胨1.2%、甘油0.6%、硫酸銨0.1%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸亞鐵0.0003%、碳酸鈣0.6%。

1.1.3 試劑

葡萄糖、酵母浸粉、瓊脂、酵母粉、蛋白胨、甘油、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸亞鐵、油酸甲酯等均為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.1.4 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀，沃特世科技上海有限公司；氣相色譜儀，安捷倫科技中國(guó)有限公司；全封閉式搖瓶機(jī)，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 刺糖多孢菌的培養(yǎng)

（1)在超凈工作臺(tái)上，刮取約25mm2的斜面菌層，接種到種子瓶培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)72h，培養(yǎng)條件28.0℃，200r/min。

（2)將種子液取出，在超凈工作臺(tái)上，按照10%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵瓶中，在28.0℃，220r/min的條件下，搖床培養(yǎng)280h。研究基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中油酸甲酯替代淀粉和不同發(fā)酵周期添加不同濃度油酸甲酯對(duì)多殺菌素發(fā)酵合成影響。每次設(shè)置3個(gè)平行樣，同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.2 油酸甲酯含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[6]。

1.2.3 多殺菌素效價(jià)的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[7]。

2 結(jié)果與討論

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基不同濃度的油酸甲酯等量替代淀粉對(duì)多殺菌素發(fā)酵影響

多殺菌素發(fā)酵過程中，在培養(yǎng)基中添加不同含量的油酸甲酯代替原工藝配方中的淀粉，會(huì)對(duì)多殺菌素合成產(chǎn)生不同程度的影響，通過試驗(yàn)確定了發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中油酸甲酯的最佳添加量，結(jié)果如表1（試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為平均值，下同)。

表1 培養(yǎng)基中不同油酸甲酯替代量對(duì)放瓶效價(jià)的影響

在培養(yǎng)基中添加油酸甲酯對(duì)多殺菌素的合成效果明顯，隨著油酸甲酯含量由2%增加到4%，放瓶效價(jià)達(dá)到2065μg/ml，比對(duì)照提高29.9%，說明油酸甲酯促進(jìn)了多殺菌素的生物合成。但當(dāng)油酸甲酯含量達(dá)到6%以后，添加量的增大反而對(duì)多殺菌素的合成產(chǎn)生反作用，培養(yǎng)基中添加8%的油酸甲酯時(shí)，放瓶效價(jià)與添加2%油酸甲酯量的效價(jià)差距不大，繼續(xù)添加可能會(huì)對(duì)多殺菌素的合成產(chǎn)生不利影響，因此，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中油酸甲酯添加量控制在4%最佳。

2.2 發(fā)酵過程補(bǔ)加油酸甲酯對(duì)多殺菌素合成的影響

2.2.1 72h添加油酸甲酯對(duì)發(fā)酵的影響

發(fā)酵運(yùn)行至72h時(shí)，在搖瓶中分別添加2%、4%、6%、8%的油酸甲酯，監(jiān)測(cè)放瓶時(shí)油酸甲酯的殘留及效價(jià)的變化，分析對(duì)多殺菌素合成的影響。具體結(jié)果如表2。

表2 72h不同油酸甲酯添加量對(duì)油酸甲酯殘留及放瓶效價(jià)的影響

在油酸甲酯殘留上，72h4組搖瓶中的油酸甲酯殘留量逐步增加，與添加量有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。效價(jià)增長(zhǎng)方面，隨著添加量增加，效價(jià)逐步提升，添加油酸甲酯量6%的組放瓶效價(jià)較對(duì)照組提高22.7%，但添加量至8%組后，效價(jià)反而低于6%添加組。經(jīng)分析認(rèn)為，出現(xiàn)以上情況可能因?yàn)樵谝欢ㄓ退峒柞舛确秶鷥?nèi)，刺糖多孢菌的次級(jí)代謝活力最強(qiáng)，油酸甲酯量濃度過低不能充分激活或誘導(dǎo)多殺菌素的生物合成，濃度過高則又抑制了微生物的次級(jí)代謝。

在多殺菌素的生物合成上，油酸甲酯添加量在一定濃度限度內(nèi)時(shí)，其效價(jià)增長(zhǎng)趨勢(shì)與發(fā)酵液中的油酸甲酯的殘留量變化趨勢(shì)類似，說明效價(jià)的增長(zhǎng)與微生物對(duì)油酸甲酯的利用率呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系，但油酸甲酯的添加超過一定限度后會(huì)反過來抑制多殺菌素的合成。

2.2.2 120h添加油酸甲酯對(duì)發(fā)酵的影響

120h時(shí)在搖瓶中分別添加2%、4%、6%、8%油酸甲酯對(duì)多殺菌素發(fā)酵的影響情況如表3。在油酸甲酯殘留方面，與72h添加實(shí)驗(yàn)類似，隨著油酸甲酯添加量的增加，發(fā)酵液中的油酸甲酯殘留也逐漸增多，尤其是添加量超過6%以后，油酸甲酯的累計(jì)速度加快，說明油酸甲酯的利用率已接近極限。

表3 120h不同油酸甲酯添加量對(duì)油酸甲酯殘留及放瓶效價(jià)的影響

在多殺菌素的合成上，此階段添加油酸甲酯比72h添加效果更為明顯。油酸甲酯添加量2%、4%、6%的3組都增加了產(chǎn)物的合成，只是增加幅度不同，其中以6%的添加量增加最為明顯。與油酸甲酯殘留趨勢(shì)類似，加量增加到8%以后，放瓶效價(jià)比6%有一定幅度的降低，說明過量的油酸甲酯對(duì)菌體的次級(jí)代謝產(chǎn)生副作用，抑制多殺菌素的合成速度。

2.2.3 168h添加油酸甲酯對(duì)發(fā)酵的影響

168h時(shí)在搖瓶中分別添加2%、4%、6%、8%的油酸甲酯對(duì)多殺菌素發(fā)酵的影響情況如表4。在油酸甲酯殘留方面可以看出，各個(gè)添加梯度殘留量基本接近線性關(guān)系，說明此階段添加的油酸甲酯已基本無法被菌體代謝利用，這可能是微生物的代謝能力進(jìn)一步下降的表現(xiàn)。

表4 168h不同油酸甲酯添加量對(duì)油酸甲酯殘留及放瓶效價(jià)的影響

對(duì)多殺菌素合成的影響方面，油酸甲酯添加量為2%、4%、6%雖然都有促進(jìn)作用，但促進(jìn)作用已不明顯，而且這3個(gè)梯度的差別不大，預(yù)計(jì)后期可能出現(xiàn)產(chǎn)物分解，效價(jià)降低。而8%油酸甲酯加量組明顯對(duì)產(chǎn)物合成有抑制作用，放瓶時(shí)效價(jià)接近對(duì)照組。從整體表現(xiàn)來看，168h時(shí)菌體的生長(zhǎng)代謝旺盛期已過，菌體已經(jīng)或接近衰亡期，此時(shí)，油酸甲酯添加不當(dāng)可能會(huì)對(duì)發(fā)酵帶來災(zāi)難性后果。

3 結(jié)論

在發(fā)酵工業(yè)中，尤其是在抗生素發(fā)酵過程中，在培養(yǎng)基中適量添加植物油既可作為消泡劑又可作為碳源參與生產(chǎn)菌的代謝反應(yīng)[8]。分析多殺菌素合成途徑，多殺菌素的合成中需要大量乙酰CoA，乙酰CoA 可由糖酵解途徑和脂肪酸分解途徑提供[9]。油酸甲酯和植物油類似，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為不飽和脂肪酸酯，分解后可產(chǎn)生多種短鏈脂肪酸和?；鵆oA，為多殺菌素的生物合成提供前提和能量供應(yīng)。

本文通過研究在基礎(chǔ)培養(yǎng)基和不同的發(fā)酵周期補(bǔ)加油酸甲酯發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中油酸甲酯的利用有一定的階段性，過高的油酸甲酯濃度會(huì)對(duì)產(chǎn)物的合成產(chǎn)生抑制作用。在發(fā)酵液中菌絲活性處于較高水平時(shí)，油酸甲酯分解利用率高，可以為菌體對(duì)產(chǎn)物的合成提供充分的前提，合成多殺菌素的能力強(qiáng)。油酸甲酯補(bǔ)加實(shí)驗(yàn)表明，分別在周期72、120 和168h 時(shí)添加不同含量的油酸甲酯，以120h 時(shí)補(bǔ)加效果最好，補(bǔ)加量6%最佳，放瓶時(shí)油酸甲酯的殘留在0.5g/100ml 左右，放瓶效價(jià)提高33.6%。本試驗(yàn)為多殺菌素的工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠依據(jù)，而多殺菌素的工業(yè)化生產(chǎn)將為我國(guó)畜牧業(yè)的綠色發(fā)展和有機(jī)養(yǎng)殖做出重要貢獻(xiàn)。