羅戈雯，何 杰，張 維

（成都醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610500）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種以成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積為病理特征的慢性肺部疾病，對于其發(fā)病機(jī)制目前沒有統(tǒng)一定論[1，2]。IPF 起病較為隱匿，呼吸困難或者肺泡炎是其早期主要表現(xiàn)，患者若出現(xiàn)了肺功能改變和影像學(xué)征象變化時，說明已經(jīng)進(jìn)展到疾病的中晚期，最終導(dǎo)致治療效果差，患者生存期短[3，4]。早期診斷和治療并加以動態(tài)評估，對于提高IPF 患者生活質(zhì)量、延緩病程具有重要的意義[5]。研究報道顯示，炎癥和免疫效應(yīng)細(xì)胞可以進(jìn)入肺內(nèi)并過度釋放肺內(nèi)活性介質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積和肺成纖維細(xì)胞的增殖；同時肺部自噬水平的不足，肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生上皮-間質(zhì)效應(yīng)，進(jìn)一步加重了肺纖維化過程[6-9]。近年來，生物信息技術(shù)逐漸運(yùn)用于呼吸系統(tǒng)疾病的靶基因篩選和機(jī)制的研究。因此，本研究通過生物信息分析技術(shù)篩選出GSE53845[10]、GSE24206[11]、GSE10667[12]三個IPF 基因芯片數(shù)據(jù)集中的自噬相關(guān)基因，通過檢測篩選出的自噬基因在IPF 患者支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）和血清中的表達(dá)量，分析其與患者肺功能、呼吸困難評分以及肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞計數(shù)等指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系，探討自噬基因在特發(fā)性肺纖維化診斷及疾病評估方面的臨床價值，為臨床治療提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從GEO 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載基因芯片數(shù)據(jù)集GSE24206、GSE10667 以及GSE53845。其中GSE24206 包含有IPF 肺組織標(biāo)本17 個和正常肺組織標(biāo)本6 個，GSE10667 包含有IPF 肺組織標(biāo)本31 個和正常肺組織標(biāo)本15 個，GSE53845 包含有IPF 肺組織標(biāo)本40個和正常肺組織標(biāo)本8 個。從人類自噬基因數(shù)據(jù)庫（HADb，http://www.autophagy.lu/）中獲取總的自噬相關(guān)基因數(shù)目222 個。

1.2 確定差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因 使用R 軟件中的limma 包篩選（篩選條件為|logFC|＞2；adj.P.Value＜0.05）差異表達(dá)的基因，并與人類自噬基因數(shù)據(jù)庫中的自噬相關(guān)基因取交集。

1.3 研究對象 選取2018 年1 月-2020 年3 月于成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科就診的74 例IPF 患者作為IPF 組，30 例常規(guī)體檢的健康者作為對照組。IPF 組男性52 例，女性22 例，病程8個月～4 年，平均病程（12.42±0.44）月，年齡49～62歲，平均年齡（55.64±5.82）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2018年的美國胸科學(xué)會（ATS）/歐洲呼吸學(xué)會（ERS）的IPF 診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]：①除外已知原因引起的間質(zhì)性肺疾病如藥物毒性作用、職業(yè)環(huán)境暴露、風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病等；②胸部HRCT 提示為普通間質(zhì)性肺炎表現(xiàn)；③經(jīng)纖支鏡活檢或支氣管肺泡灌洗檢查后排除其他疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他嚴(yán)重肺部疾?。虎诤喜?yán)重心腦血管疾??；③合并風(fēng)濕免疫性疾病或惡性腫瘤、職業(yè)暴露等引起的肺間質(zhì)纖維化；④具有明確病因所導(dǎo)致的呼吸困難和肺功能檢查結(jié)果的異常。對照組男15 例，女15 例，年齡50～58 歲，平均年齡（54.52±2.83）歲。對照組既往無呼吸系統(tǒng)相關(guān)的慢性疾病，近期肺功能及胸部CT 均無明顯異常，也無呼吸道感染癥狀。本研究通過成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會討論同意，倫理號20180124B，所有研究對象均充分了解實(shí)驗(yàn)?zāi)康募白饔?，并分別簽署知情同意書。

1.4 方法 支氣管肺泡灌洗與血清采樣：患者經(jīng)常規(guī)局部麻醉后行纖支鏡檢查，選擇左肺舌葉或右肺中葉進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，在選定的肺葉開口處注入100 ml 溫度為35 ℃的生理鹽水，將BALF 回收至收集瓶中，回收率＞35%，收集BALF 后立即進(jìn)行靜脈采血5 ml。BALF 經(jīng)無菌紗布過濾以后注入離心管中，在4 ℃環(huán)境以1200 r/min 的速度離心10 min，取上清液注入無菌透析袋10 倍濃縮，再浸入到50%聚乙二醇溶液中10 倍濃縮，24 h 后加入生理鹽水，取濃縮液置于-80 ℃冰箱保存以備用。檢測時提取原液體積的10%復(fù)溶，沉淀物經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢測，檢測的試驗(yàn)方法參考《中華醫(yī)學(xué)會呼吸分會支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)檢測技術(shù)規(guī)范（草案）》[14]。靜脈采樣血液經(jīng)離心后，取上清液于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，將所有患者的血清和灌洗液收集齊后一次性檢測。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 BALF 和血清中的NAMPT 水平檢測 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測兩組研究對象血清和BALF 中NAMPT 水平，試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司（編號：TMl060212）提供。用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算NAMPT 的濃度（ng/ml）。

1.5.2 肺功能檢查 記錄用力肺活量（FVC）、一氧化碳彌散量占預(yù)計值百分比（DLCO%）、第一秒用力呼氣容積占預(yù)計值百分比（FEV1%）。

1.5.3 呼吸困難評分測定 納入的IPF 患者均參照改良英國醫(yī)學(xué)研究委員會呼吸困難量表評分（mMRC）[15，16]評估呼吸困難程度，見表1。

表1 呼吸困難評分（分）

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；線性相關(guān)性分析采用Pearson 法，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息分析結(jié)果 GSE53845 篩選出差異基因92 個、GSE24206 篩選出差異基因51 個、GSE10667篩選出差異基因134 個，見圖1，三個數(shù)據(jù)集與自噬相關(guān)基因取交集篩選出1 個自噬相關(guān)基因NAMPT，見圖2。

圖1 三個數(shù)據(jù)集的熱圖

圖2 自噬相關(guān)基因的韋恩圖

2.2 兩組BALF 和血清中NAMPT 水平比較 IPF 組患者BALF 中及血清中的NAMPT 水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組BALF 和血清中的NAMPT 水平比較（，ng/ml）

表2 兩組BALF 和血清中的NAMPT 水平比較（，ng/ml）

2.3 兩組細(xì)胞學(xué)總數(shù)及分類計數(shù)比較 IPF 組BALF中巨噬細(xì)胞百分?jǐn)?shù)高于對照組，淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 兩組細(xì)胞學(xué)總數(shù)及分類計數(shù)比較（）

表3 兩組細(xì)胞學(xué)總數(shù)及分類計數(shù)比較（）

2.4 IPF 組BALF 和血清中NAMPT 水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性 IPF 組患者BALF 中NAMPT 水平與FEV1%、FVC 和DLCO%呈負(fù)相關(guān)（r=-0.687，-0.701，-0.622，P＜0.05）；血清中NAMPT 水平與DLCO%呈負(fù)相關(guān)（r=-0.414，P＜0.05）；IPF 組患者mMRC 評分為（2.90±1.32）分，患者BALF 和血清中的NAMPT 水平與mMRC 呈正相關(guān)（r=0.544，0.532，P＜0.05），見表4。

表4 IPF 組BALF 和血清中NAMPT 水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

IPF 是間質(zhì)性肺炎中的一種常見類型，起病隱匿且發(fā)病機(jī)制不清，主要臨床癥狀缺乏特異性，表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、呼吸困難，較容易與COPD、支氣管擴(kuò)張癥、塵肺等其他呼吸系統(tǒng)慢性疾病相混淆[17]。然而，IPF 一旦出現(xiàn)了典型的影像學(xué)改變或者肺功能檢查提示有限制性通氣功能障礙，說明疾病已經(jīng)進(jìn)展到了中晚期[18]。由于缺乏有效的IPF 藥物治療，大多數(shù)患者確診后的中位生存期僅為2.5～4 年，預(yù)后極差[19]。目前臨床上通常采用臨床表現(xiàn)、影像學(xué)評估以及肺功能檢測等方法對IPF 進(jìn)行疾病診斷和預(yù)后評估，但是上述方法的敏感性和特異性均不高，而且評價項(xiàng)目過于繁多復(fù)雜，在診斷的過程中很容易受到臨床醫(yī)生存在的主觀因素的干擾，最終降低了對于IPF 診斷的準(zhǔn)確性[20]。肺組織病理活檢雖然是診斷IPF 病情進(jìn)展的金標(biāo)準(zhǔn)，但獲取肺組織的方式通常采用開胸肺活檢或者冷凍肺活檢，這種有創(chuàng)性操作技術(shù)難度大，風(fēng)險高，在基層醫(yī)院難以廣泛開展。因此，積極尋求一種簡便的IPF 相關(guān)血清生物標(biāo)志物顯得十分重要。

IPF 預(yù)防和治療的理論基礎(chǔ)來自該病的發(fā)病機(jī)制，國內(nèi)外許多研究從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬、炎癥因子等多個方面探究了IPF 的發(fā)病機(jī)制，雖然未完全揭露IPF 的病因，但是深刻了對IPF疾病的認(rèn)識，尤其在細(xì)胞自噬領(lǐng)域開展了一系列對于IPF 機(jī)制的研究[21]。Sosulski ML 等[22]通過構(gòu)建肺纖維化模型發(fā)現(xiàn)，模型中泛素化蛋白水平和多功能蛋白p62 水平高于對照組；通過直觀的細(xì)胞電鏡對肺纖維化模型進(jìn)行觀測發(fā)現(xiàn)模型中自噬體數(shù)量明顯減少，這些現(xiàn)象均提示了肺纖維化過程中肺內(nèi)伴有明顯的自噬不足。細(xì)胞自噬在一個適度的水平可以保持肺組織細(xì)胞活性和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，然而在肺纖維化形成的過程中細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致了細(xì)胞自噬功能的失調(diào)。Romero Y 等[23]研究指出，IPF 中的肺成纖維細(xì)胞顯示出持續(xù)的mTOR 通路激活，而該通路對自噬有抑制作用，激活的mTOR 信號通路導(dǎo)致自噬水平明顯不足，促進(jìn)了肌成纖維細(xì)胞的分化，最終導(dǎo)致肺纖維化的形成。本研究通過生物信息分析技術(shù)篩查IPF 相關(guān)的自噬基因發(fā)現(xiàn)，在GSE53845、GSE24206、GSE10667 三個IPF 相關(guān)數(shù)據(jù)集中，自噬基因NAMPT 都存在著過表達(dá)，NAMPT同時也是哺乳動物細(xì)胞煙酰胺腺嘌呤二核苷酸補(bǔ)救合成通路的限速酶，參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)重要的病理生理過程，在細(xì)胞自噬過程中，NAMPT 可以合成NAD，激活去乙酰化酶SIRT1 和PARP，從而抑制細(xì)胞自噬，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖；被釋放到細(xì)胞外的NAMPT 還與其他炎癥因子存在一定的交互作用，一方面炎癥因子如白介素-1、TNF-α、TGF-β 能刺激NAMPT 釋放，另一方面NAMPT 也能顯著上調(diào)白介素-1、TNF-α、TGF-β 等細(xì)胞因子的表達(dá)[24，25]。因此，NAMPT 所具有的調(diào)節(jié)免疫和抑制細(xì)胞自噬的功能在IPF 的機(jī)制中可能發(fā)揮著重要作用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證生物信息分析結(jié)果，本研究比較了IPF 患者和健康對照者的BALF 和血清中NAMPT 水平、BALF 中的細(xì)胞計數(shù)及肺功能結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩組檢測結(jié)果的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；將IPF 患者血清及BALF 中的NAMPT 水平與肺功能和mMRC 評分進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)IPF組患者BALF 中NAMPT 水平與FEV1%、FVC 呈負(fù)相關(guān)；血清中NAMPT 水平中的NAMPT 與DLCO%也呈負(fù)相關(guān)，IPF 組患者BALF 和血清中的NAMPT水平與mMRC 呈正相關(guān)，提示肺功能越差的IPF 患者其血清和肺泡灌洗液中的NAMPT 水平越高，分析其原因可能與NAMPT 過表達(dá)導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞自噬功能下降，肺成纖維細(xì)胞過度增殖有關(guān)。由此可見，血清和BALF 中NAMPT 水平可作為評估IPF病情嚴(yán)重程度的一個可靠指標(biāo)。而血清和BALF 的測定具有簡便性和可重復(fù)性，可用于臨床監(jiān)測IPF患者病情變化。本研究也有一定局限性，由于納入研究的病例數(shù)較少，隨訪時間太短，未對患者的生存預(yù)后與NAMPT 的關(guān)系進(jìn)行更深入的探索，因此在今后的研究中，本課題組將擴(kuò)大樣本量和延長隨訪時間，以期對本研究結(jié)果進(jìn)行更進(jìn)一步的確認(rèn)。

綜上所述，IPF 患者BALF 和血清中NAMPT 水平明顯升高，且與患者肺功能和呼吸困難評分顯著相關(guān)，有助于對IPF 患者的病情狀況進(jìn)行長期動態(tài)評估。