柴仲秋，戴廣法，周 冰

（1.天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院肛腸科，天津 300000；2.天津市濱海新區(qū)新港街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，天津 300000）

結(jié)直腸腫瘤（colorectal neoplasms）是世界范圍高發(fā)病率、高死亡率的消化道系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率居全球惡性腫瘤第3 位，死亡率居第2 位[1]。隨著研究的深入，目前已發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)微環(huán)境的相互作用對(duì)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后影響重大[2]，而這一過程與中醫(yī)證候的整體觀念具有極大的相似性?！白C”是對(duì)致病因素與機(jī)體反應(yīng)性的綜合情況，是對(duì)疾病當(dāng)前本質(zhì)所作的結(jié)論。近年來，針對(duì)結(jié)直腸腫瘤中醫(yī)證候本質(zhì)的研究日益增多，但應(yīng)用組織進(jìn)行差異表達(dá)蛋白分析的研究相對(duì)較少。在辨證基礎(chǔ)上對(duì)腫瘤組織和正常組織的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行篩選可能對(duì)結(jié)直腸腫瘤的疾病發(fā)展、治療和轉(zhuǎn)歸提供新的研究方向。本研究在前期調(diào)查中發(fā)現(xiàn)脾氣虛證是結(jié)直腸腫瘤的常見證候之一[3]，因此以脾氣虛患者為研究對(duì)象開展相關(guān)研究，探索結(jié)直腸腫瘤脾氣虛證患者腫瘤組織與正常組織的差異表達(dá)蛋白，尋找該證型的中醫(yī)治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012 年8 月-2019 年8 月因結(jié)直腸腫瘤就診于天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院行手術(shù)治療的患者作為研究對(duì)象。參照中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中醫(yī)肛腸科常見病診療指南[4]、Dukes 分期及AJCC/UICC TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病情分期判定。參照證素診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，對(duì)每位患者的四診信息進(jìn)行歸類整理和證候判定。證候診斷為脾氣虛證的患者共38 例，其中男21例，女17 例，年齡48～65 歲，平均年齡（55.16±13.15）歲；TNM 分期：Ⅰ期20 例、Ⅱ期11 例、Ⅲ期7 例，病理大體分型：隆起型6 例、潰瘍型8 例、隆起潰瘍型18 例、浸潤(rùn)型6 例；病理類型腺癌31 例、黏液腺癌4 例、印戒細(xì)胞癌1 例、腺癌并印戒細(xì)胞癌2 例。

1.2 方法 手術(shù)切除腫瘤后分別取患者癌灶腸管組織及遠(yuǎn)端正常腸管組織，各2 份，立即置液氮凍存。將樣本用液氮預(yù)冷的砸碎器砸碎，液氮研磨，提取蛋白同時(shí)進(jìn)行分組標(biāo)記（腫瘤組織標(biāo)記為113，正常組織標(biāo)記為114）。BSA 法定量檢測(cè)蛋白質(zhì)水平；在高pH條件下進(jìn)行反相色譜分離后的得到的組分采取夾心法上Loading Pump 以流速3 μl/min 進(jìn)行分離。設(shè)置質(zhì)譜參數(shù)后，進(jìn)行質(zhì)譜分析。根據(jù)蛋白的定量信息，選取上下調(diào)差異倍數(shù)≥1.4 的蛋白作為差異蛋白。

1.3 生物信息解析 將差異表達(dá)的蛋白輸入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能和基因檢索，將對(duì)應(yīng)基因保存為TXT 文件，輸入到Metascape，選擇選擇H.Sapiens，然后選擇Express Analysis，自動(dòng)生成對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行的通路富集和分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)蛋白 脾氣虛證腫瘤組織與正常組織中差異蛋白總數(shù)為140 個(gè)，其中上調(diào)71 個(gè)，下調(diào)69個(gè)。進(jìn)一步篩選上下調(diào)差異倍數(shù)≥1.6 倍的差異蛋白總數(shù)為42 個(gè)，其中上調(diào)蛋白20 個(gè)，見表1，下調(diào)蛋白22 個(gè)，見表2。

表1 脾氣虛證腫瘤組織與正常組織比較上調(diào)的蛋白

表2 脾氣虛證腫瘤組織與正常組織比較下調(diào)的蛋白

表2 （續(xù)）

2.2 差異表達(dá)蛋白分析 應(yīng)用Metascape 對(duì)上下調(diào)差異倍數(shù)≥1.4 倍的140 個(gè)差異蛋白進(jìn)行通路富集，其中排名前20 的通路見表3 和圖1；主要生物過程見圖2，主要集中在平滑肌收縮、氣體運(yùn)輸、粒細(xì)胞激活、Nop56p-associated pre-rRNA 復(fù)合體、血管平滑肌收縮、防御反應(yīng)的積極調(diào)節(jié)、RNA 代謝等。

圖1 差異表達(dá)蛋白的通路富集（TOP 20）

圖2 差異表達(dá)蛋白的主要生物過程

表3 差異表達(dá)蛋白的通路富集

3 討論

近年來，整體觀念指導(dǎo)下的中醫(yī)辨證論治逐漸成為結(jié)直腸癌治療方案中不可忽視的一環(huán)，其積極作用也日益顯現(xiàn)。然而由于缺乏客觀、穩(wěn)定的診斷及療效評(píng)價(jià)指標(biāo)，中醫(yī)證候的辨識(shí)模糊且不穩(wěn)定。辨證論治是中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)的精髓，證候是中醫(yī)立法處方的依據(jù)。因此，在整個(gè)中醫(yī)藥理論體系的框架內(nèi)，中醫(yī)的證候問題始終處于核心的地位，它是連接臨床和基礎(chǔ)理論的橋梁，也是中醫(yī)藥理論現(xiàn)代化能夠取得突破的關(guān)鍵點(diǎn)。近年來眾多學(xué)者開展了結(jié)直腸癌中醫(yī)證候規(guī)范化及證候間差異表達(dá)因子的研究，為結(jié)直腸癌中醫(yī)證候客觀化奠定了基礎(chǔ)，提供了有益的研究方向。

王洪琦等[5]采用免疫組化法、ELISA 法和RTPCR 法對(duì)腫瘤組織中HSP70 和P53 進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌熱證組、熱證合計(jì)組HSP70、P53 的陽性率均明顯高于各非熱證組。杜國(guó)亮等[6]采用免疫組化法對(duì)腫瘤組織蛋白P21WAF1 和p21H-ras 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)虛證組p21WAFl 陽性表達(dá)水平顯著低于實(shí)證及虛實(shí)夾雜證組。吳蘇冬等[7]應(yīng)用免疫組化法對(duì)腫瘤組織蛋白p53、Bcl-2 和Bax 進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，脾虛組患者p53，Bcl-2 蛋白的陽性表達(dá)率及表達(dá)水平顯著高于非脾虛組。羅明等[8]采用免疫組化法對(duì)腫瘤組織CD44v6 及PCNA 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或全身多處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者，實(shí)證較虛證CD44v6 的表達(dá)明顯增高。周小軍等[9-11]采用通過雙向凝膠電泳的方法對(duì)腫瘤組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，同時(shí)聯(lián)用質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)濕熱蘊(yùn)結(jié)證、氣血虧虛證結(jié)直腸癌患者腫瘤組織之間，以及兩組患者與正常人結(jié)腸黏膜組織間的差異蛋白質(zhì)主要為熱休克蛋白（HSP）、細(xì)胞骨架蛋白、抗氧化蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白、能量產(chǎn)生相關(guān)蛋白、血液蛋白等。趙海燕等[12]同樣通過雙向凝膠電泳對(duì)腫瘤組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并聯(lián)合質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)血瘀組較健康組和氣血虧虛組的IL-8、維生素D 結(jié)合蛋白前體、β-GDP 解離抑制因子、α-二酯酰甘油激酶表達(dá)均上調(diào)，而纖維結(jié)合蛋白（FN）均下調(diào)；同時(shí)，血瘀組較健康組上調(diào)而較氣血虧虛組下調(diào)的為腫瘤基因DJ-1、載脂蛋白A-I 前體、軟骨關(guān)聯(lián)性蛋白前體；血瘀組較健康組下調(diào)、而較氣血虧虛組上調(diào)的為ADP 核糖基化類蛋白15、血清淀粉樣蛋白A。龔秀麗等[13]通過免疫組化方法對(duì)虛實(shí)兩組證候的正常組織、癌旁組織和腫瘤組織檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、成纖維細(xì)胞激活蛋白（FAP）、成纖維細(xì)胞特異蛋白（S1O0A6）、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）、平足蛋白podoplanin（PDPN）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)虛實(shí)兩組的癌組織、癌旁組織和正常組織中上述活化成纖維細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)差異不明顯。洪朝金等[14]采用人全基因組芯片檢測(cè)大腸癌組織差異表達(dá)基因，篩選并分析陰虛證癌組織組和癌周正常組織組的差異表達(dá)基因，并利用Pathway 對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸癌圍手術(shù)期患者陰虛證癌組織組和癌周正常組織組表達(dá)的差異基因共4869 個(gè)，包括上調(diào)基因1574 個(gè)，下調(diào)基因3295 個(gè)，主要涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)吞功能、礦物質(zhì)吸收、酮體合成與分解功能、免疫功能等相關(guān)基因，其主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括MAPK 信號(hào)通路及p53 信號(hào)通路等。白玉茹[15]的研究為探尋脾虛濕盛型大腸癌的客觀依據(jù)，其選取23 例經(jīng)病理確診的脾虛濕盛型大腸癌患者的組織進(jìn)行iTRAQ 定量蛋白鑒定并進(jìn)行生信分析和WB驗(yàn)證。結(jié)果顯示MGST2、RRM2、SRM、GSTT1、GPX3、GSTM3 6 個(gè)差異蛋白經(jīng)WB 驗(yàn)證與iTRAQ結(jié)果一致，為脾虛濕盛型大腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的研究提供了新的線索。季青等[16]的研究顯示，肝腎陰虛證和無證可辨的大腸癌、肝癌患者的血漿蛋白中共同的差異蛋白有8 個(gè)，主要與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)途徑有緊密聯(lián)系，認(rèn)為KNG1、HBA2 等蛋白可能是大腸癌和肝癌“異病同證”的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，脾氣虛證結(jié)直腸腫瘤組織與正常組織中差異表達(dá)蛋白的通路主要集中在平滑肌收縮、氣體運(yùn)輸、粒細(xì)胞激活、Nop56p-associated prerRNA 復(fù)合體、血管平滑肌收縮、防御反應(yīng)的積極調(diào)節(jié)、RNA 代謝、Vesicle-mediated 轉(zhuǎn)運(yùn)、Wnt 信號(hào)通路、平面細(xì)胞極性通路、DNA 代謝過程的負(fù)調(diào)控、核導(dǎo)入、突觸傳遞的正調(diào)控、線粒體組織、中間絲狀細(xì)胞骨架組織、膠原蛋白生物合成過程、鋅離子反應(yīng)、調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-12 的產(chǎn)生、細(xì)胞生長(zhǎng)、生長(zhǎng)因子受體和第二信使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)疾病、通過受體酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)等中。蛋白組學(xué)技術(shù)在傳統(tǒng)中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用[17]是現(xiàn)有研究手段中的熱點(diǎn)，但由于蛋白組技術(shù)的復(fù)雜程度更高，涉及到復(fù)雜的分離、擴(kuò)增、純化和翻譯后修飾，因此迫切依托高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的研究技術(shù)平臺(tái)來開展高水平研究。但隨著蛋白芯片、雙向電泳、蛋白質(zhì)譜等技術(shù)的不斷成熟與使用，蛋白組學(xué)技術(shù)將在闡明中醫(yī)藥防治大腸癌機(jī)制上發(fā)揮重要作用。除蛋白組學(xué)外，研究者還嘗試應(yīng)用代謝組學(xué)[18-20]、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)[21]、系統(tǒng)生物學(xué)[22，23]、表觀遺傳學(xué)[24]以及基因多態(tài)性[25]等方法來嘗試研究中醫(yī)證候本質(zhì)，為該領(lǐng)域研究的深入提供了更多的研究方向。

綜上所述，脾氣虛證結(jié)直腸腫瘤患者腫瘤組織與正常組織間的蛋白表達(dá)存在差異，其差異蛋白的生物過程主要集中在平滑肌收縮、氣體運(yùn)輸、粒細(xì)胞激活等通路中，這些通路對(duì)脾氣虛證的結(jié)直腸腫瘤的形成具有重要影響。