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        超高效液相色譜—串聯(lián)質譜法測定蜂蜜中10-羥基-2-癸烯酸

        2021-09-21 08:16:02胡麗俐皮露露陳先桂
        食品與機械 2021年8期

        胡麗俐 黎 瑛 汪 輝 皮露露 陳先桂 蔣 莉

        (長沙市食品藥品檢驗所國家酒類產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗中心,湖南 長沙 410006)

        蜂蜜是一種營養(yǎng)豐富的天然食品,其中60%~80%是人體容易吸收的葡萄糖和果糖,還含有豐富的礦物質、維生素、氨基酸、酶等生物活性成分,具有抗菌消炎、抗氧化防衰老、抗癌增強免疫等生物功能,對骨質疏松癥、胃腸道問題以及肝臟、心血管疾病有治療作用[1]。隨著消費者對蜂蜜需求量的增加,蜂蜜市場造假現(xiàn)象日趨嚴重,假蜂蜜不僅對人體的滋補效果較小,還容易引發(fā)肥胖、糖尿病、高血壓、脂肪肝、急慢性腎損傷等疾病,嚴重危害消費者的身體健康[2]。同時,這種不正當?shù)母偁帗p害了正規(guī)商戶的利益,擾亂了正常的市場秩序。蜂蜜造假手段多樣,常見的造假模式是以葡萄糖、果糖糖漿等為原料,添加色素、蜂蜜香精進行勾兌[3-4]。目前已建立了多種蜂蜜的鑒別檢測方法,但大多數(shù)是基于蜂蜜外源性摻假物質成分的分析[5],而有關其內(nèi)源性成分的分析方法較少。

        10-羥基-2-癸烯酸(10-HDA)是由Butenandt從蜂王漿中分離出來,并且通過紅外光譜確定了其結構[6]。10-HDA主要分泌于工蜂的上顎腺[7]。潘建國等[8-9]先后從蜂膠和蜂王胎中成功分離出10-HDA,平均含量分別為0.22%和0.15%?,F(xiàn)有10-HDA的檢測方法主要有高效液相色譜法[10-11]、氣相色譜法[12]、氣相色譜—質譜聯(lián)用法[13]、薄層色譜法[14]、毛細管電泳法[15-16]、分光光度法[17]和紅外光譜法[18]等。氣相色譜法需進行甲基化衍生,操作繁瑣;薄層色譜法易受試驗環(huán)境等多因素影響,方法重現(xiàn)性差。以上方法僅適用于蜂王漿及其制劑中高含量10-HDA的測定,對于含量較低的蜂蜜難以達到檢測要求。試驗擬建立10-HDA的超高效液相色譜—串聯(lián)質譜方法,并結合固相萃取技術實現(xiàn)蜂蜜中10-HDA的測定,以期為蜂蜜的真假鑒別提供一種內(nèi)源性成分分析方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        10-羥基-2-癸烯酸(10-HDA)標準品:純度>97.5%,中國食品藥品鑒定研究院;

        乙酸銨:分析純,國藥集團化學試劑有限公司;

        甲醇、乙腈:色譜純,德國Merck公司;

        試驗用水:超純水,美國Millipore超純水儀制備;

        固相萃取柱:ProElut PLS 200 mg/6 mL,北京迪馬科技有限公司;

        蜂蜜:市售。

        1.2 儀器與設備

        超高效液相色譜儀:1290 Infinity Ⅱ型,美國安捷倫科技有限公司;

        三重四級桿串聯(lián)質譜儀:6470型,美國安捷倫科技有限公司;

        電子天平:XS205DU型,梅特勒—托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司;

        超聲波清洗儀:KQ5200DE型,昆山市超聲儀器有限公司;

        固相萃取裝置:HSE-24B型,天津市恒奧科技發(fā)展有限公司;

        氮吹儀:N-ECAP45型,美國Organomation 公司;

        渦旋混合器:SK-1型,江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。

        1.3 方法

        1.3.1 標準溶液的配制

        (1) 標準儲備液:準確稱取10-HDA標準品10.56 mg,用甲醇溶解并定容至100 mL,配制成100 μg/mL的標準儲備液,于-20 ℃避光保存。

        (2) 標準中間液:準確吸取標準儲備液1.00 mL,用甲醇稀釋并定容至100 mL,配制成1.00 μg/mL的標準中間液,于-20 ℃避光保存。

        (3) 溶劑標準工作液配制:準確吸取一定體積的1.00 μg/mL的標準中間液至10 mL容量瓶中,甲醇定容,配制成質量濃度分別為0.05,0.10,0.20,0.40,0.60,0.80 μg/mL的標準工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

        (4) 基質匹配標準工作液配制:將1.3.2凈化處理后的基質溶液氮氣吹干,分別準確吸取1.00 mL相應濃度的標準溶液復溶,配制成質量濃度分別為0.05,0.10,0.20,0.40,0.60,0.80 μg/mL的基質匹配標準工作液,經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾,現(xiàn)用現(xiàn)配。

        1.3.2 樣品前處理

        (1)提?。簻蚀_稱取1.00 g試樣置于10 mL螺旋蓋聚丙烯離心管中,加入8 mL甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=4∶6),渦旋溶解,超聲提取10 min,用甲醇—水溶液定容至10 mL,待凈化。

        (2) 凈化:準確吸取5 mL提取液,加入到預先用5 mL甲醇和5 mL水平衡的ProElut PLS 200 mg/6 mL固相萃取柱中,用5 mL水進行淋洗,棄去所有流出液,抽干固相萃取柱,再用5 mL甲醇進行洗脫,收集洗脫液,于40 ℃水浴下氮氣吹至近干,加入甲醇溶解并定容至1 mL,渦旋混勻1 min,經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾,供超高效液相色譜—串聯(lián)質譜測定。

        1.3.3 前處理條件優(yōu)化 按1.3.2的方法對樣品前處理過程中的提取溶劑(V甲醇∶V水=2∶8,3∶7,4∶6,5∶5,6∶4,7∶3,8∶2)進行優(yōu)化。

        1.3.4 液相色譜條件優(yōu)化 采用Agilent ZORBAX SB C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm)對目標物進行分離,優(yōu)化有機相和水相溶液,通過比較峰形和響應,選擇合適的流動相(乙腈—水、甲醇—水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨、甲醇-5 mmol/L乙酸銨)。優(yōu)化梯度洗脫程序,確定液相色譜條件。

        1.3.5 質譜條件優(yōu)化 分別在電噴霧正離子(ESI+)和電噴霧負離子(ESI-)模式下進行Scan掃描,得到對應的質譜總離子流圖,確定化合物的母離子。對選定的母離子進行Product ion掃描,得到二級質譜圖,選取豐度最強的碎片離子作為定量離子,次強的碎片離子作為定性離子,分別對子離子的碰撞能進行優(yōu)化。在多反應監(jiān)測模式(MRM)下,優(yōu)化干燥氣溫度、干燥氣流量、霧化氣壓力、鞘氣溫度、鞘氣流量、毛細管電壓、噴嘴電壓等參數(shù)。

        1.3.6 方法學驗證

        (1) 基質效應:分別用甲醇和1.3.2凈化處理后的基質溶液制備相同濃度的低、中、高3個水平的標準工作溶液,評價基質效應。

        (2) 線性范圍、檢出限和定量限:配制質量濃度分別為 0.05,0.10,0.20,0.40,0.60,0.80 μg/mL的基質匹配標準工作液,繪制基質匹配標準曲線。取代表樣品,逐步定量地添加標準溶液,按1.3.2的方法進行處理,信噪比>3時的添加量為檢出限,信噪比>10時的添加量為定量限。

        (3) 準確度和精密度:取代表樣品進行低、中、高3個濃度水平添加,每個添加水平平行測定6次,計算回收率。同時對等分樣品進行6次平行測定,評估目標物的日內(nèi)精密度。連續(xù)3 d內(nèi),對等分樣品進行6次平行測定,評估目標物的日間精密度。

        (4) 干擾試驗:在代表樣品提取液中加入喹諾酮類、四環(huán)素類、氯霉素類藥物,配成最終質量濃度均為0.10 μg/mL的溶液,用試驗方法進行分析,考察其他物質對目標物是否存在干擾。

        1.3.7 數(shù)據(jù)處理 測量數(shù)據(jù)由Data Acquisition 進行采集,定量軟件Quantitative Analysis 10.0 分析,使用Origin軟件作圖。

        2 結果與分析

        2.1 前處理條件的確定

        試驗發(fā)現(xiàn),當樣品提取液經(jīng)過固相萃取小柱時,強極性物質如果糖和葡萄糖等直接流出,目標物10-HDA被吸附在小柱上,先用水淋洗將樣品中殘留的強極性雜質去除,再用甲醇將10-HDA 洗脫下來。當提取溶劑中甲醇體積分數(shù)≤40%時,提取液經(jīng)ProElut PLS固相萃取小柱的流出液和水淋洗液中均未檢測到10-HDA;當V甲醇∶V水=5∶5時,流出液中檢出10-HDA。故采用甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=4∶6)作為提取溶液。

        2.2 液相色譜條件的確定

        結果表明,采用乙腈—水為流動相體系時,10-HDA的響應值最高,但峰形不佳;采用甲醇—水為流動相體系時,10-HDA的響應一般,且峰形較差;采用乙腈-0.1%甲酸水和甲醇-0.1%甲酸水為流動相體系時,10-HDA離子化受到抑制,響應明顯降低;采用乙腈-5 mmol/L乙酸銨、甲醇-5 mmol/L乙酸銨為流動相體系時,均能得到良好的峰形、最佳的分離效果和穩(wěn)定的響應值(見圖1)。由于甲醇毒性較小且成本較低,因此選擇5 mmol/L乙酸銨(A)—甲醇(B)作為流動相,優(yōu)化梯度洗脫程序見表1,色譜柱溫度為35 ℃,進樣量為5 μL。

        1. 10-HDA a. 乙腈-0.1%甲酸 b. 乙腈-5 mmol/L乙酸銨 c. 甲醇-5 mmol/L乙酸銨 d. 乙腈-水 e. 甲醇-0.1%甲酸 f. 甲醇—水

        表1 梯度洗脫程序

        2.3 質譜條件的確定

        10-HDA的分子式為C10H18O3,相對分子質量為186.2。試驗過程中, ESI+、ESI-模式下準分子離子峰[M+H]+和[M-H]-的m/z分別為187.2,184.9,ESI-模式下的響應值高于ESI+的,故采用ESI-模式。在ESI-模式下,選擇m/z為184.9的離子作為母離子,進行Product ion掃描,得到10-HDA的二級質譜圖。10-HDA在碰撞室中主要碎裂成m/z為138.8,110.8的碎片,推測其可能的裂解途徑為圖2。選擇184.9/138.8、184.9/110.8離子對作為多反應監(jiān)測(MRM)的離子對,其中184.9/138.8的響應值更高,故將其作為定量離子對,184.9/110.8作為定性離子對。在多反應監(jiān)測(MRM)下優(yōu)化各項參數(shù),得干燥氣溫度為325 ℃、干燥氣流量為8 L/min、霧化氣壓力為0.31 MPa、鞘氣溫度為400 ℃、鞘氣流量為11 L/min、毛細管電壓為-3 500 V、噴嘴電壓為500 V,目標物的相關質譜參數(shù)見表2。

        圖2 10-HDA可能的裂解途徑

        表2 10-HDA的質譜參數(shù)

        2.4 方法學驗證

        2.4.1 基質效應評價 樣品基質中的干擾物質對目標物電離效率的影響用基質效應(ME)來評價。當|ME|≤20%時,基質效應對結果的準確性影響不大,可以忽略不計;當|ME|>20%時,基質效應較強,對定量結果會產(chǎn)生較大干擾。由表3可知,蜂蜜中10-HDA在低、中、高3個濃度水平的ME為-29.9%~-45.5%,存在明顯基質抑制效應。因此,采用基質匹配標準曲線來定量,以獲得更加準確的結果。

        表3 蜂蜜中10-HDA的基質效應

        2.4.2 線性范圍、檢出限和定量限 10-HDA的基質匹配標準溶液在0.05~0.80 μg/mL質量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系,線性回歸方程為Y=12.4X-283.7,相關系數(shù)為0.995。方法的檢出限為 0.03 mg/kg,定量限為 0.10 mg/kg。

        2.4.3 準確度和精密度 在0.10,0.20,1.00 mg/kg添加濃度水平下,10-HDA的平均回收率為96.9%~108.3%,相對標準偏差為4.5%~10.7%。由表4可知,日內(nèi)精密度和日間精密度分別為5.9%~9.2%和3.5%~14.3%。

        表4 方法的回收率與精密度

        2.4.4 干擾試驗 文獻[19-20]報道,蜂蜜中可能有喹諾酮類、四環(huán)素類、氯霉素類、硝基呋喃類藥物殘留。采用試驗方法分析含有以上藥物的溶液,在目標物保留時間區(qū)域未發(fā)現(xiàn)干擾,將以上藥物加入到代表性樣品中,目標物濃度未發(fā)生改變[21]。因此,試驗方法有良好的抗干擾能力。

        2.5 實際樣品分析

        應用試驗方法對12個蜂蜜樣品進行檢測,由圖3可知,除1個假蜂蜜樣品未檢出10-HDA外,其余11個蜂蜜樣品中均有檢出10-HDA,最高含量為0.96 mg/kg,最低含量為0.22 mg/kg,說明10-HDA作為內(nèi)源性成分在蜂蜜中普遍存在的。

        圖3 基質標準溶液和典型樣品溶液MRM色譜圖

        3 結論

        建立了蜂蜜中10-羥基-2-癸烯酸的超高效液相色譜—串聯(lián)質譜檢測方法。該方法操作簡便,無需進行氣相色譜法繁瑣的衍生化處理;靈敏度高,檢出限和線性范圍等參數(shù)均優(yōu)于高效液相色譜法;且重現(xiàn)性好,抗干擾能力強于薄層色譜法。試驗方法能夠滿足蜂蜜中10-羥基-2-癸烯酸的定性定量分析。由于蜂蜜中10-羥基-2-癸烯酸的含量受蜜源種類、地理環(huán)境等因素影響,后續(xù)將加大對不同種類和產(chǎn)地的蜂蜜監(jiān)測,完善蜂蜜中10-羥基-2-癸烯酸含量的數(shù)據(jù)。

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