李媛媛，溫 瑜，李 俊，李鵬飛，白天宇，張慶濤，王 穎

(太原理工大學 生物醫(yī)學工程學院，太原 030024)

隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷提升，器官替換或組織再生的需求正在迅速擴大，而供體器官的數(shù)量遠遠不夠[1]。組織工程在過去幾年里得到了更多應用，作為制作仿生微型人體組織模型的工具，目的是提高藥物篩選的準確性和促進個性化醫(yī)學。然而，除了一些簡單的器官如皮膚[2]和軟骨[3]外，制造復雜的活體組織仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。而3D生物打印技術(shù)的研究進展，使我們離實現(xiàn)組織工程的宏偉目標又近了一步。原則上，理想的生物墨水應該具有適合生物打印過程的物理化學性質(zhì)，生物打印后的組織應具有與天然生物組織相似的生物活性及力學性能，而以水凝膠為基礎(chǔ)包覆活細胞和生物活性成分的生物墨水最受歡迎[4]。為此，許多基于水凝膠的生物墨水制劑，如明膠甲基丙烯?；鶃啺?，丙烯酸酯功能化聚乙二醇，海藻酸鈉，瓊脂糖和膠原蛋白已被采用，或單獨使用或組合使用。

利用明膠作為生物材料，通過共價交聯(lián)方法克服了明膠在體溫下的不穩(wěn)定性[5]。GelMA是明膠和甲基丙酸酐(MA)反應的產(chǎn)物。除此之外，MA對明膠的化學接枝率會很低，也就意味著大部分RGD基序、MMP可降解基序基本不會受到影響，這將確保GelMA保持良好的細胞黏附性能和降解性[6]。GelMA作為一種性能優(yōu)異的水凝膠，已被證實可打印成多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且細胞存活率較高[7]，也可用于組織工程的載細胞構(gòu)建體[8]。到目前為止，各種基于GelMA的生物墨水已經(jīng)被開發(fā)出來，允許打印出復雜組織結(jié)構(gòu)，可用于人工血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以及牙周缺損修復材料。因此，GelMA將在生物打印中發(fā)揮更重要的作用，以促進功能組織和仿生組織的生成。而通過混合GelMA與其他生物材料制備復合水凝膠來提高其性能也成為當下研究的熱點。殼聚糖CS是幾丁質(zhì)的部分去乙?；苌颷9]，由于其相當可觀的抗菌和止血性能已經(jīng)被當作組織工程理想的支架材料[10]。明膠與殼聚糖的混合物由于其優(yōu)異的生物學性能，被制作成各種支架應用于組織工程的眾多領(lǐng)域，如皮膚[11]、軟骨[12]、骨[13]、神經(jīng)[14]、肝臟[15]等。

在水凝膠的使用中，物理特性(即孔隙率、彈性模量、降解和水溶脹)的表征，決定其是否適合不同組織工程應用。本研究進行了GelMA前體和ChelMA前體的制備；其次，制備了GelMA及其復合水凝膠(添加ChelMA、PEG(200)DA)，并對其進行力學和物理性能檢測，并比較得出適合用于打印人工材料的復合水凝膠。通過制備不同配比的GelMA復合水凝膠，可有效改善GelMA的力學性能，使其滿足不同組織器官的機械性能，并調(diào)節(jié)微觀結(jié)構(gòu)(溶脹性和孔隙率)，為今后進一步引入生物活性細胞及應用于不同的活體材料奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

明膠(藥用級，購自Solarbio公司)，殼聚糖(脫乙酰度為75%～85%，中分子量，購自Macklin公司)，甲基丙烯酸酐(純度94%，購自Sigma-Aldrich公司)，PEG(200)DA(購自Sigma-Aldrich公司)，光引發(fā)劑Irgacure2959(購自Sigma-Aldrich公司)。本研究所用的試劑和溶液均為試劑級。

1.2 GelMA和ChelMA的合成

GelMA前體合成[16-17]：將10 g明膠溶于100 mL PBS溶液中，磁力攪拌。然后將MA溶液(質(zhì)量比8%)滴加到上述混合物中，反應2 h后，將混合溶液在去離子水中透析一周，冷凍干燥后得到GelMA前體。將5 g殼聚糖溶解在200 mL醋酸(質(zhì)量濃度3%)[18]溶液中，磁力攪拌。然后滴加8 mL MA溶液到上述混合物中，反應2 h后，將混合溶液在去離子水中透析一周，冷凍干燥后得到CS-MA前體，本文中將此混合物簡稱為ChelMA.

1.3 GelMA，GelMA-ChelMA和GelMA-PEG(200)DA水凝膠的制備

稱取一定量GelMA前體，分別加入Irgacure 2959水溶液中，在紫外光照射5 min后聚合成質(zhì)量分數(shù)為10%，15%，20%，25%的GelMA.在Irgacure 2959水溶液中加入0.9 g ChelMA前體，制備質(zhì)量濃度為3%的ChelMA溶液。將GelMA溶液和ChelMA溶液按1∶4，2∶3，1∶1，4∶1，3∶2的體積比例混合，紫外光照射5 min后得到GelMA-ChelMA水凝膠。在GelMA溶液中加入體積分數(shù)為30%，40%，50%，60%的PEG(200)DA溶液，紫外光照射5 min后得到GelMA-PEG(200)DA水凝膠[19]。

1.4 FTIR分析

將明膠、GelMA前體、殼聚糖和ChelMA前體凍干，利用Shimadzu FT-IR光譜儀進行紅外測試，分辨率為2 cm-1，波數(shù)范圍為400 cm-1～4 000 cm-1.

1.5 力學性能分析

光固化后的水凝膠用萬能試驗機分別進行單向壓縮試驗表征光交聯(lián)GelMA水凝膠，GelMA-ChelMA復合水凝膠，GelMA-PEG(200)DA復合水凝膠的力學性能。以3 mm/min的位移速率壓縮，壓縮至原高度的40%.

1.6 SEM分析

將凍干后的GelMA、GelMA-ChelMA水凝膠和GelMA-PEG(200)DA水凝膠切片，噴金，用掃描電子顯微鏡觀察樣品表面特征。

1.7 吸水率、溶脹率及交聯(lián)率分析

取冷凍干燥的GelMA水凝膠、GelMA-ChelMA水凝膠、GelMA-PEG(200)DA水凝膠稱重，記為m1.將樣品浸泡在PBS溶液中，保溫37 ℃，分別在0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0 h時取出樣品，稱重記為m2.計算每個時刻下的吸水率W；之后繼續(xù)溶脹，24 h后稱重記為m3.最后再冷凍干燥，稱重記為m4，計算溶脹率S和交聯(lián)率Y[19].每組做3次實驗，取平均值。

(1)

(2)

Y=(m4-m1)×100% .

(3)

1.8 孔隙率分析

取冷凍干燥的GelMA水凝膠、GelMA-ChelMA水凝膠、GelMA-PEG(200)DA水凝膠在無水乙醇中浸泡，不發(fā)生溶脹行為，用乙醇置換的方法測定孔隙率[20]。方法如下：取干態(tài)水凝膠稱重，記為md，用無水乙醇浸沒樣品，用真空泵進行抽真空，直到干態(tài)水凝膠沉底，取出稱重為ms，計算孔隙率q.

(4)

式中：ρ是乙醇在24.5 ℃時的密度(0.79 g/mL)；V是支架的體積。每組3個樣品，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 GelMA，GelMA-ChelMA和GelMA-PEG(200)DA水凝膠的合成

紫外光下，光引發(fā)劑形成自由基，與GelMA、ChelMA上的光敏性甲基丙烯酰胺基團的雙鍵發(fā)生反應，使GelMA、ChelMA上帶有自由基，之后進行自由位點的轉(zhuǎn)移，進攻GelMA、ChelMA上游離的甲基丙烯酰胺基團雙鍵，直至共聚反應終止，最后形成交聯(lián)分子鏈。明膠雖然含有大量的氨基，但是進行丙烯?；奈稽c卻很少，所以在發(fā)生酰化反應后，分子上光敏性基團也很少。其次，明膠屬于大分子，空間位阻較大，會降低GelMA的交聯(lián)率。所以在GelMA中添加小分子量的PEG(200)DA，空間位阻會?。怀酥?，加入PEG(200)DA使反應體系中雙鍵數(shù)量增加，交聯(lián)點隨之也會增加，最后生成三維網(wǎng)絡(luò)聚合物。PEG(200)DA的加入，能夠提供更多活性基團，使水凝膠交聯(lián)度提高，解決單純GelMA光交聯(lián)存在的問題。

從水凝膠合成圖可以看出，水凝膠呈現(xiàn)果凍狀，顏色為淡乳白色且滲透著淡黃色。如圖1(a)從左到右依次為質(zhì)量分數(shù)10%、15%、20%、25%的GelMA，隨著濃度的增加，水凝膠的顏色變得越來越黃。圖1(b)從左到右依次為GelMA和ChelMA體積比為1∶4，2∶3，1∶1，3∶2，4∶1，隨著體積比的增大，水凝膠的淺黃色逐漸變淺。圖1(c)從左到右依次為GelMA中加入體積分數(shù)30%，40%，50%，60%的PEG(200)DA，隨著PEG(200)DA的體積分數(shù)逐漸增加，水凝膠的顏色也逐漸變白。

圖1 (a) 不同質(zhì)量分數(shù)的GelMA；(b) 不同體積比的GelMA和ChelMA；(c) 不同體積分數(shù)的GelMA-PEG(200)DAFig.1 (a) Different concentrations of GelMA；(b) Different ratios of GelMA to ChelMA；(c) Different concentrations of GelMA-PEGDA

2.2 FTIR分析

圖2 (a) GelMA和明膠的紅外光譜；(b) ChelMA和殼聚糖的紅外光譜Fig.2 (a) FTIR spectra of GelMA and Gelatin；(b) FTIR spectra of ChelMA and CS

2.3 SEM表征結(jié)果

根據(jù)3種水凝膠的SEM圖像(如圖3所示)顯示，其表面結(jié)構(gòu)存在很大的不同。由圖3可知：GelMA水凝膠質(zhì)量濃度的增加對其孔洞大小無明顯影響。而GelMA-ChelMA的孔狀結(jié)構(gòu)幾乎全被一層膜遮蓋，并且隨著CS濃度的減小，孔洞更大，孔壁更厚，說明更多的大分子鏈被纏繞和結(jié)合在一起。加入PEG(200)DA后，水凝膠表面孔隙結(jié)構(gòu)與另兩種材料有區(qū)別，結(jié)構(gòu)表面仍呈現(xiàn)孔狀結(jié)構(gòu)，但表面的孔比較粗糙，可能是由于材料韌性斷裂而引起。

圖3 不同水凝膠的SEM表征Fig.3 Morphology of various hydrogels

2.4 力學性能分析

圖4為GelMA，GelMA-ChelMA和GelMA-PEG(200)DA水凝膠的典型壓縮曲線和彈性模量值。圖4可見隨著GelMA質(zhì)量濃度的增加彈性模量也增加，且增加較明顯。GelMA與ChelMA體積比增大，彈性模量減小，但是減小不明顯。說明在GelMA中添加ChelMA，可以增強力學性能。隨著PEG(200)DA體積分數(shù)的增大，彈性模量顯著增大。相較于GelMA水凝膠、GelMA-ChelMA復合水凝膠，GelMA-PEG(200)DA復合水凝膠的彈性模量很大，是因為加入PEG(200)DA使GelMA分子鏈之間的交聯(lián)密度增大從而起到了類似交聯(lián)劑的作用[19]，說明PEG(200)DA的加入，可以顯著增強力學性能。圖4顯示，雖然加入PEG(200)DA的水凝膠彈性模量會增大，但是變得更易破壞，在應變?yōu)?0%左右發(fā)生破壞。

圖4 三種水凝膠的機械性能Fig.4 Mechanical behaviors of three hydrogels

2.5 吸水率、溶脹率及交聯(lián)率分析結(jié)果

圖5顯示，隨著時間的增加，3種水凝膠都是在0.5 h內(nèi)吸水最快，雖然0.5 h之后吸水率仍在增大，但變化很小，慢慢趨于穩(wěn)定。GelMA質(zhì)量濃度升高，吸水率減小。GelMA與ChelMA的體積比變大，吸水能力變?nèi)?。PEG(200)DA體積分數(shù)增大，吸水率減小。GelMA-PEG(200)DA復合水凝膠的吸水率普遍低于GelMA水凝膠、GelMA-ChelMA復合水凝膠。質(zhì)量分數(shù)10%的GelMA水凝膠吸水率高于3∶2，4∶1(GelMA與ChelMA體積比)的GelMA-ChelMA復合水凝膠；質(zhì)量分數(shù)15%，20%，25%的GelMA水凝膠吸水率均低于GelMA-ChelMA復合水凝膠的吸水率。

圖5 各種水凝膠的吸水率Fig.5 Water absorption of various hydrogels

表1顯示，GelMA溶液中添加ChelMA和PEG(200)DA，可以一定程度上提高水凝膠的交聯(lián)率，也可以一定程度上降低溶脹率；GelMA-PEG(200)DA復合水凝膠的溶脹率，顯著低于GelMA水凝膠和GelMA-ChelMA復合水凝膠，說明添加PEG(200)DA后，可以改善水凝膠的溶脹性。Gel-MA質(zhì)量濃度升高，溶脹率減小，交聯(lián)率也減小，可能是由于明膠的分子量大，濃度增高使其空間位阻增大導致。GelMA和ChelMA體積比增大，溶脹率和交聯(lián)率都減小。ChelMA和GelMA上的紫外光引發(fā)活性中心都比較少，交聯(lián)反應受到影響，隨之降低。PEG(200)DA體積分數(shù)的增大，交聯(lián)率增大，溶脹率降低。PEG(200)DA中雙丙烯酸酯基團的增加使交聯(lián)點增加，隨之交聯(lián)率就會增加。

表1 三種水凝膠的物理特性Table 1 Physical properties of three hydrogels %

2.6 孔隙率分析

由圖6可知，GelMA質(zhì)量分數(shù)的增加，孔隙率減小，說明GelMA水凝膠質(zhì)量濃度越大，形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加的緊密。GelMA與ChelMA的體積比增大，孔隙率減小，但是減小不明顯，但仍可以說明加入ChelMA會影響GelMA水凝膠的孔隙率，會使GelMA水凝膠更加緊密。PEG(200)DA體積分數(shù)的增大，孔隙率減小，是因為PEG(200)DA的加入使GelMA分子之間的連接更加緊密。

圖6 各種水凝膠的孔隙率Fig.6 Poriness of various hydrogels

3 結(jié)論

綜上所述，在GelMA中加入ChelMA和PEG(200)DA，以滿足不同組織和器官的力學性能。彈性模量增大，吸水率、溶脹率、交聯(lián)率、孔隙率、表面形貌和結(jié)構(gòu)均受到一定影響。特別是GelMA-PEGDA水凝膠，彈性模量顯著增加，吸水率和溶脹率顯著降低。PEG(200)DA的加入加快了反應速率，使單體在短時間內(nèi)轉(zhuǎn)化為聚合物，也提高了GelMA水凝膠分子之間的交聯(lián)度。水在這個聚合網(wǎng)絡(luò)中的擴散速率會減慢，導致吸水率顯著降低。ChelMA和GelMA的紫外激活中心較少，光交聯(lián)效率較低，而PEGDA中的雙丙烯酸基團提高了交聯(lián)度。通過在GelMA中加入殼聚糖和PEG(200)DA，可以得出最適宜的GelMA與ChelMA和PEG(200)DA的各種比例，來滿足多種生物醫(yī)學應用的多樣化需求，以及滿足生物打印的多種需求，也提高GelMA了作為生物醫(yī)用材料的應用需求。