李韙韜，寧 雪，張 歡，張雅檬，錢志余

（1.南京航空航天大學自動化學院，南京 211106；2.南京工程學院計算機工程學院，南京 211167）

引 言

消化道疾病是威脅人類身體健康的一大因素，臨床上常用的診斷方法是通過內鏡獲取消化道組織結構信息來進行疾病的診療，必要時會進行組織取樣活檢。消化內鏡檢測具有侵入性小、創(chuàng)傷低、花銷小等優(yōu)勢［1］，但是大多內鏡僅能獲取病變組織的結構信息，很少內鏡可以檢測到與疾病代謝相關的功能信息。研究表明，代謝的情況可以通過血液血紅蛋白和代謝產物的含量變化來反映。氧含量不足會導致生命體無法進行正常的生理活動，同時消化道疾病與消化道氧飽和度有著很大的相關性［2］。王巍等［3］對胃癌患者血液樣品進行拉曼光譜分析，發(fā)現(xiàn)胃癌患者氧合血紅蛋白（HbO）表面增強。韓聯(lián)［4］研究經皮血氧飽和度監(jiān)測是否可以診斷新生兒先天性心臟病，研究發(fā)現(xiàn)經皮血氧飽和度監(jiān)測可以作為新生兒先天性心臟病診斷的指標。

目前血氧成像的主要手段是雙波長以及三波長成像，這兩種技術只考慮了血紅蛋白對于可見光的吸收。但是，與人體組織代謝相關的生色團還包括細胞色素C（cytochrome C）、細胞色素氧化酶、黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）。研究表明，在多種疾病如心血管疾病、癌癥、敗血癥、腦組織損傷、糖尿病和神經性的疾病等，細胞色素C 氧化酶缺陷致心腦肌病［5］。細胞色素氧化酶在人體內分布十分廣泛［6］，與人類疾病的發(fā)生有密切關關系，作為臨床診斷傾向線粒體肌病的重要指標［7］。施慧群等［8］通過分析細胞色素氧化酶活性，對高壓氧治療對支氣管哮喘患者血清趨化因子和免疫T 細胞的影響進行了研究。 黃素腺嘌呤二核苷酸遞氫體（Flavine adenine dinucleotide reduced，F(xiàn)ADH2）氧化態(tài)為FAD，F(xiàn)ADH2 中的H2分離成游離的氫離子和電子，F(xiàn)AD 濃度變化可以反映FADH2濃度變化。 Soliz 等［9］研究煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）和FADH2相關線粒體呼吸活性在兩種帕金森病小鼠模型中變化情況，發(fā)現(xiàn)均顯著降低，NADH 和FADH2可以作為腦部疾病的觀察指標。與生物組織散射特性相關的約化散射系數（μ's）是顱腦創(chuàng)傷等多種疾病監(jiān)測的良好指標參數［10］?；谏鲜? 種物質的吸收光譜，本文選用了六波長內源光信號成像技術進行血氧及與代謝相關參數成像，設計了基于內源光信號的纖維光學內鏡，在保證系統(tǒng)能準確測量結構信息的基礎上，設計實驗進行了血氧及代謝相關參數信息測量。

1 內源光信號成像技術

1.1 技術原理

內源光信號（Optical intrinsic signal，OIS）成像是一種血氧和代謝產物成像技術，無需造影劑以及熒光染料。OIS 采用了多個波長進行成像，得到多種生色團的濃度變化量圖像，相較傳統(tǒng)方法，具有更高的準確性，且同一視野，并且可以提供多種生色團的數據，而這些生色團的濃度變化也可能與人體某些疾病有著密切相關，可作為診療依據。

在波長選擇上，根據幾種物質的吸收特性［11］，脫氧血紅蛋白（HbR）在600 nm 波長時對光的吸收明顯高于氧合血紅蛋白，二者的等吸收點是500 和570 nm 波長，因此選取這3 個波長。細胞色素C 以及細胞色素氧化酶總是存在兩種狀態(tài)下的相互轉換，濃度之和不變。分析其吸收光譜，在550 nm 處細胞色素C 出現(xiàn)差分吸收峰，在450 和600 nm 處細胞色素氧化酶出現(xiàn)差分吸收峰。通過分析FAD 的吸收光譜，發(fā)現(xiàn)FAD 在450 和470 nm 處存在吸收峰。NADH 的吸收峰值在紫外波段，可以忽略不計。同時，組織的散射特性也影響著內源光信號成像的最終結果。最終，選取上述6 個波長。

1.2 成像算法

朗伯比爾定律描述了特定波長的光穿過某一物質時該物質吸收之后的光強變化量與該物質的濃度以及光程之間的關系為［12］

式中：Ii和Io為入射光和出射光的強度，ε為摩爾消光系數，c為物質濃度，L為光程差，用吸光度A來表示經過組織后光的強度變化。

選取某一時刻為基準，即0 時刻，0 時刻的吸光度定義為

式中：c0為0 時刻的物質濃度；Ii，0，Io，0分別為0 時刻的出射光和入射光的強度；A0為0 時刻的吸光度。

時刻t的吸光度為

則兩時刻吸光度的差為

式中Δc為物質濃度的變化。在實驗過程中，入射光的強度是不變的，即Ii，t=Ii，0，那么式（4）可簡化為

物質濃度的變化Δc與出射光強Io的變化有關。反射光R來代替出射光Io，基線時刻所測光強R0，t時刻所測光強Rt。因人體吸光物質的多樣性，并且光的波長不同，在組織中的穿透深度不同，于是得到

式中：Δci和εi(λ)分別為第i種生色團的濃度和摩爾消光系數變化；Da(λ)表示差分路徑因子［12］，是修正的朗伯比爾定律中一個重要參數［13］，其與波長有關，組織在不同波長光的平均自由程能被反映，可代替光程差L。

散射在光學內源信號分析中需要考慮。將其視為偽生色團，式（6）中加入散射特性變化量Δs，故將式（6）修正為

為簡化計算，將組織散射看作一個偽色團，那么μ's(λ) 定義為約化散射系數，Δs是散射變化的變量，Ds(λ) 是和散射偽色團有關的差分路徑因子［13］。 根據模特卡羅模擬得到差分路徑因子（Da(λ) 和Ds(λ)）隨吸收系數μa和約化散射系數μ's的變化曲線［13］。通過文獻［14］可獲得6 種物質摩爾消光系數εi(λ)、約化散射系數μ's(λ)、6 個波長下與生色團以及散射偽生色團相關的差分路徑因子Da(λ)和Ds(λ)，代入式（7）的系數矩陣。然后測量兩個時間點或兩種狀態(tài)下的光信號變化量，可以解得6 種生色團的濃度變化量Δci。

2 基于內源光信號的纖維光學內鏡系統(tǒng)

2.1 硬件系統(tǒng)

基于內源光信號的纖維光學內鏡系統(tǒng)如圖1 所示，整個系統(tǒng)由寬帶光源、纖維內鏡、濾光片輪以及電荷耦合器件（Charge coupled device，CCD）相機構成。光纖胃鏡內部含有12 000 根傳像光纖所組成的光纖束，外部用聚氨酯涂塑軟管，與目前臨床內鏡所用材料一致，傳像光纖的單絲分辨率為13 μm，總長度為1 050 mm，整體直徑10 mm。在光纖束前端安裝有透鏡，可以擴展視野，視場角為120°。內鏡前部可以上、下、左、右4 個方位旋轉，旋轉角度大于90°。內鏡還加入了器械通道和水汽通道，器械通道可以通入器械進行活體組織取樣，直徑為1.5 mm；水汽通道直徑1.2 mm，可以沖洗鏡頭，輔助止血，或者對某些器官充氣使組織平滑。同時含有調焦旋鈕，通過轉動調焦旋鈕使圖像達到最清晰狀態(tài)。

圖1 基于內源光信號的纖維光學內鏡系統(tǒng)Fig.1 Fiber optic endoscopy system based on endogenous optical signal

寬帶光源可以通過螺紋與內鏡連接，寬帶光可以準直進入光纖內鏡，經傳光光纖傳輸，照射在生物組織上，經生物組織吸收之后出射光被傳像光纖收集。經傳輸被濾光片濾除其他波段的光，只留下某一波長的出射光，被CCD 采集并轉換成數字信號。數字信號通過USB 接口連接到計算機，經計算機接收進行圖像處理。

2.2 軟件系統(tǒng)

采用LabVIEW 和MATLAB 為工具開發(fā)了采集、控制和圖像處理軟件系統(tǒng)，實現(xiàn)了血氧及與代謝相關參數的成像。軟件所實現(xiàn)的功能主要包括以下幾方面：可以實時觀察圖像；可以自動或者手動調整曝光時間、增益以及曝光補償模式3 個參數，使圖像質量達到最佳；能夠選擇采集張數，節(jié)省采集時間；可以設置保存路徑，將圖像保存在指定位置。

3 實驗驗證

3.1 實驗模型

實驗采用小鼠耳朵作為目標成像，觀察注射了過量亞硝酸鈉的小鼠在不同時間的氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的濃度變化，判斷其是否符合小鼠心肌缺血死亡過程中的生理變化規(guī)律，同時驗證系統(tǒng)其他參數的有效性。

研究所采用的小鼠是美國癌癥研究所（Institute of Cancer Research，ICR）雌性小鼠，小鼠出生后約8 周，將其在恒溫恒濕（溫度為25±1 ℃，濕度為55±10 %）環(huán)境中飼養(yǎng)7 d，在此過程中保證水以及食物充足。通過對小鼠腹腔注射過量亞硝酸鈉溶液致小鼠亞硝酸鹽中毒，在此過程中亞硝酸鈉實際上是作為一種氧化劑。經血液循環(huán)，發(fā)揮其氧化性，將血紅蛋白中的鐵元素轉換成三價態(tài)，這樣的血紅蛋白無法攜帶氧，于是就導致組織和器官氧氣供應不足［15］。

3.2 實驗設計

首先對小鼠耳部進行脫毛并清理干凈，將小鼠耳部粘貼在透明玻璃板上并放置在鋪了白紙的位移臺上，連接系統(tǒng)。接著將放置了小鼠的位移臺移至纖維光學內鏡的探頭處，調整位置，探頭端面與小鼠耳部的距離為5 mm 左右。首先在注射藥物之前拍攝在此過程的450、470、500、550、570 以及600 nm 六波長圖像，每拍攝一個波長的圖片，記錄下在此波長下的曝光時間、增益以及曝光補償模式3 個參數，等到曝光時間結束之后，旋轉濾光片輪到下一個波長。濾光片輪上的濾光片是按照波長大小依次排列，因此使得旋轉過程很便捷，這樣依次拍攝，直到6 個波長的圖像都拍攝完畢，至此一個時間點的圖像采集結束。接著給小鼠注射過量亞硝酸鈉溶液（800 mg/kg），在注射藥物后3、6、9、12、15 以及18 min 采集六波長圖像，實驗結束。

4 實驗結果

4.1 6 種生色團的濃度變化

由本系統(tǒng)所拍攝的六波長原始圖像如圖2 所示?？梢娦∈蠖垦芮逦梢?，但每種波長下的原始圖像不相同，在600 nm 波長下的小鼠耳部圖像的對比度出現(xiàn)明顯下降，清晰度不足。采用文獻中的差分路徑因子、摩爾消光系數以及散射系數，根據內源光信號的算法公式，得到6 種生色團濃度變化的圖像如圖3 所示。圖3 為注射藥物之后18 min 相對于注射藥物之前的6 種生色團濃度變化圖像，其中ΔHbO 為氧合血紅蛋白濃度變化，ΔHbR 為脫氧血紅蛋白濃度變化，ΔCyt?C 為細胞色素C 濃度變化，ΔCCO 為細胞色素氯化酶濃度變化，ΔFAD 為黃素腺嘌呤二核苷酸濃度變化，ΔLS 為光散射濃度變化。

圖2 波長原始圖Fig.2 Original wavelength map

圖3 生色團濃度變化圖Fig.3 Changes of chromophores map

4.2 氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白濃度變化

對氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的濃度變化著重分析。采用上述的圖像處理方法對6 個時間點的36 張圖像進行處理，獲得了氧合血紅蛋白濃度變化量和脫氧血紅蛋白濃度隨時間變化的圖像分別如圖4，5 所示。

圖4 氧合血紅蛋白濃度變化量隨時間變化圖像Fig.4 Images of oxy-hemoglobin concentration change with time

4.3 氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白濃度變化曲線

為了能更直觀地體現(xiàn)注射藥物之后兩種物質與注射藥物之前的濃度變化量隨時間變化規(guī)律，對氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白圖像取了一個感興趣區(qū)域，計算平均灰度值。因為圖像矩陣都是通過內源光信號血氧成像算法公式所計算得到的，因此每一個灰度值都代表該時刻該像素點相對于注射藥物之前的生色團濃度變化量，感興趣區(qū)域的平均灰度值也就是該區(qū)域的平均濃度變化量。氧合血紅蛋白的含量3 min 為-0.525×10-5mol/L 逐漸減少至18 min 為-2.25×10-5mol/L，具有差異性（p<0.05）。脫氧血紅蛋白的變化量3 min 為1.0×10-5mol/L 逐漸增加至18 min 為3.20×10-5mol/L，具有差異性（p<0.05）。二者變化情況如圖6，7 所示。

圖6 氧合血紅蛋白濃度變化量隨時間變化曲線Fig.6 Oxy-hemoglobin concentration variation with time

5 討 論

論文根據內源光信號成像原理，所設計的內窺成像系統(tǒng)可以獲得與人體組織類似的血管結構和功能信息。人體毛細血管的直徑為9 μm，而小鼠耳朵的微動脈口徑不超過7 μm，微靜脈的口徑在13 μm左右，微毛細血管的口徑不超過4 μm。胃黏膜血管是人體毛細血管［16］，因此直徑與人體毛細血管直徑較為相近。同時，選用小鼠耳部作為實驗目標血管，可以避免了采用其他部位作為實驗目標的復雜操作。圖2 表明系統(tǒng)可以獲得清晰的血管結構圖像［17］，圖3 表明系統(tǒng)可以獲得6 種與代謝相關的信息的變化圖像。

亞硝酸鈉實際上是作為一種氧化劑。經血液循環(huán)，發(fā)揮其氧化性，將血紅蛋白中的鐵元素轉換成三價態(tài)，這樣的血紅蛋白無法攜帶氧，于是就導致組織和器官氧氣供應不足，導致氧合血紅蛋白下降、脫氧血紅蛋白上升。通過建立小鼠亞硝酸鹽中毒試驗模型，驗證基于內源光信號的纖維光學內鏡系統(tǒng)測量效果。結果可見小鼠耳部氧合血紅蛋白及脫氧血紅蛋白均有顯著變化。圖4 小鼠耳部血管的亮度變化減少，表明注射藥物之后氧和血紅蛋白的濃度是持續(xù)減少。圖5 小鼠耳部血管的亮度變化增加，表明注射藥物之后脫氧血紅蛋白的濃度是持續(xù)增加。

圖5 脫氧血紅蛋白濃度變化量隨時間變化圖像Fig.5 Images of deoxyhemoglobin concentration change with time

圖6 和圖7 對圖4 和圖5 中的感興趣區(qū)濃度變化進行計算。得出氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白濃度隨時間變化的曲線。圖6 的曲線在數值上表明注射藥物之后的氧合血紅蛋白濃度相對于注射藥物之前持續(xù)降低。圖7 表明脫氧血紅蛋白的濃度都呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢，與圖6 呈現(xiàn)反比趨勢。因此數據可以驗證：注射藥物之后，血紅蛋白無法與氧結合，導致大量血紅蛋白處于脫氧狀態(tài)，相反脫氧血紅蛋白的濃度不斷增加。通過數據分析，更加直觀地體現(xiàn)了兩種物質濃度變化量的變化趨勢，從而說明了本系統(tǒng)在進行血氧成像［17］方面地有效性。實驗結果與實際的小鼠生理變化相符，也證實了內源光信號的纖維光學內鏡系統(tǒng)能夠準確反映生物組織功能信息的變化規(guī)律。

圖7 脫氧血紅蛋白濃度變化量隨時間變化曲線Fig.7 Hemoglobin concentration variation with time

6 結束語

本文主要介紹了基于內源光信號的纖維光學內鏡系統(tǒng)，包括硬件及軟件系統(tǒng)。接著對系統(tǒng)進行實驗驗證，通過對小鼠注射過量亞硝酸鈉致小鼠心肌缺血死亡，拍攝在注射藥物之前以及注射藥物之后的六波長圖像，運用內源光信號成像算法計算注射藥物之后不同時刻6 種生色團的濃度變化量，發(fā)現(xiàn)氧合血紅蛋白濃度持續(xù)下降，脫氧血紅蛋白濃度則呈相反趨勢。論文的研究結果表明所開發(fā)的纖維光學內鏡系統(tǒng)可以獲得組織的功能信息變化圖像，在臨床上具有重要的應用價值。