張雅檬，寧 雪，李韙韜，趙月梅，張 歡，錢志余

（1.南京航空航天大學自動化學院，南京 211106；2.南京工程學院計算機工程學院，南京 211167）

引 言

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是一種脂質(zhì)和多糖的復合物，可造成顱腦損傷［1］。其主要病理機制為LPS 刺激多種細胞因子如IL?113、TNF?α 等突破血腦屏障，激活顱內(nèi)小膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞等，誘導顱內(nèi)發(fā)生炎癥反應(yīng)［2?3］。對脂多糖的研究有利于臨床上為其引起的病癥進行針對性和特異性的深入治療。甘露醇是大分子高滲性利尿劑，在神經(jīng)外科中具有脫水和降低顱內(nèi)壓的作用，同時還能夠擴張血容量，減輕腦血管痙攣，緩解腦損傷作用［4?5］。

高滲鹽水是較新的治療方案，已應(yīng)用于治療腦梗死、出血或外傷性腦損傷引起的腦水腫等方面［6?7］。在動物研究和臨床試驗中，與等摩爾劑量的甘露醇相比，高滲鹽水在治療由腦出血、缺血性或創(chuàng)傷性腦損傷引起的腦水腫方面更有效［8］。在兔細菌性腦膜炎模型實驗中，利用3% 氯化鈉進行腦膜炎治療發(fā)現(xiàn)可以減輕腦水腫和腦損傷，且效果優(yōu)于20% 甘露醇［9］。因此在評估脂多糖誘導腦損傷的恢復中，采用甘露醇和高滲鹽水作為治療劑。

血管方面的測量常用的技術(shù)有磁共振成像，熒光血管造影成像及X 射線血管造影成像等，但各種成像手段在針對血流成像時都有不足之處［10］。磁共振成像多用于整體成像，且時間分辨率和空間分辨率較低，成像成本高，不便進行大量的重復實驗。熒光血管造影成像和X 射線血管造影成像通常用來提供解剖學物理結(jié)構(gòu)信息，需要注射造影劑會造成部分過敏現(xiàn)象，其次代謝作用導致無法提供長時間連續(xù)監(jiān)測［11?12］。本文采用的激光散斑襯比成像能提供實時無掃描區(qū)域整體功能性成像，并且獲得的圖像具有高分辨率、快速和非侵入等諸多優(yōu)點。采用的光譜分析檢測腦血氧值能夠?qū)崟r在體檢測，并且易于和激光散斑同步記錄［13?14］。

本文將血流和血氧兩個極其重要的生理參數(shù)用于脂多糖誘導腦損傷模型的研究中，并進一步探討7.5% 高滲鈉和20% 甘露醇作用于LPS 誘導小鼠腦損傷的血氧和血流的整體變化情況。同時，采用聯(lián)合光譜和激光散斑技術(shù)實時測量LPS 誘導腦損傷情況以及甘露醇和高滲鹽水治療效果，而在以往的研究中一般僅僅利用光譜分析技術(shù)或激光散斑成像技術(shù)進行實驗，并未探討其中腦血流和血氧的關(guān)聯(lián)性。腦血流和腦血氧都描述了腦神經(jīng)代謝相關(guān)的生理信息，利用聯(lián)合監(jiān)測技術(shù)對血氧和血流進行聯(lián)合檢測研究，這在生理研究、臨床研究等方面同樣具有重大的意義。

1 實驗系統(tǒng)組成與基本原理

1.1 聯(lián)合光譜和激光散斑系統(tǒng)

激光散斑系統(tǒng)由HeNe 激光（HNL150L?EC，Thorlab）、擴束鏡、反光鏡、12 倍光學鏡筒（1?50486A，Navitar）、CCD 相機（GS3?U3?51S5M?C，Point?Grey）組成，同時血氧監(jiān)測系統(tǒng)由光纖（直徑200 μm，定制）、鹵素光源（HL2000?HP?FHSA，海洋光學）和光纖光譜儀（FX?2000，海洋光學）組成，如圖1 所示。激光散斑成像與血氧監(jiān)測系統(tǒng)實現(xiàn)實時同步測量。

圖1 光譜與激光散斑聯(lián)合實驗系統(tǒng)Fig.1 Joint experiment system of spectrum and laser speckle

1.2 實驗原理

利用激光散斑時空聯(lián)合襯比算法計算小鼠的血流信息，卷積窗口為NS×NS×Nt（單張圖像滑動窗口大小為NS×NS，共Nt張圖像）大小的長方體，通過計算該單元內(nèi)的均值和方差得到黑色像素點的襯比值，依次滑過整張圖片得到襯比圖。通過增加單次計算時的計算單元大小，兼顧了空間分辨率和時間分辨率。在不需要提供系統(tǒng)硬件升級的情況下提高了圖像質(zhì)量。襯比度首先由Goodman 提出，用于對運動模糊的程度進行量化分析［15］。研究人員將襯比度定義為光強的標準方差和平均光強的比值，即

式中：δs表示強度波動的標準偏差；I表示強度波動的均值。當散斑襯比值為1 時，說明物體表面沒有任何模糊，即物體處于靜止狀態(tài)；當襯比值為0 時，說明粒子運動速度足夠快。

相機各像素點能夠探測到的光強應(yīng)為一段時間內(nèi)像素點接受到的光強的積分和，考慮光強和電場的自相關(guān)函數(shù)以及兩者滿足的sieger 關(guān)系公式等進行推算，最終得到

式中：x=T/τc，T為采集圖像時設(shè)置的曝光時間，即積分時間，τc表示相關(guān)時間，τc∝1/v。雖無法解釋其確切的物理關(guān)系，但τc與紅細胞的運動速度v成反比。在曝光時間T一定的情況下，速度v與x成正比，通過牛頓迭代法得到式（2）中的x，就得到了代表速度的一種相對值［16］。圖2 為LPS 組某一只小鼠實驗過程中血流流速變化圖（偽彩），采集時間為20~80 min，間隔為20 min，從圖2 可看出血流速度逐漸升高。采用人工選定感興趣區(qū)域（Region of interest，ROI），ROI 一般選擇主血管區(qū)域，并通過平均ROI 的血流值獲取腦血流（rCBF）值。

圖2 LPS 組小鼠實驗過程中血流流速變化圖Fig.2 Map of blood flow velocity changes in LPS group mice during the experiment

光譜分析中常用的模型是朗伯比爾定律，它主要描述的是光在穿過組織前后的光強變化，其表達式為

式中：Ii和Io分別表示為光在通過樣品前后的光強；A通常被稱作吸光度；c為樣品的濃度；L為光程；ε為摩爾消光系數(shù)。而在通常情況下，保證入射光的光強一致，也就是Ii，o=Ii，t，所以表達式為

式中：R0，Rt分別為0 時刻和t時刻測得的光強強度。在生理過程中，有多種物質(zhì)表現(xiàn)出濃度上的變化，除了考慮生物體各個組織的吸收之外，接收到的光強還和組織的散射有關(guān)［17］。在光譜分析時，將散射視作另一個偽色團，從而式（4）可更詳細地表達為

式中：λ代表波長；εi代表生色團的摩爾消光系數(shù)；Δci表示生色團的濃度變化；Da則被稱為差分路徑因子，不同波長的光在組織中的光路徑不盡相同［18?19］；μ's(λ) 是與色團摩爾消光系數(shù)類似的約化散射系數(shù)；Δs用來表示散射的變化；Ds(λ)是偽色團的差分路徑因子。通過式（5）可推算出具體的各生色團的濃度變化和光散射的相對變化。

本實驗采用歸一化模型，將注射前的各參數(shù)作為基準值，其后注射藥劑或者生理鹽水后與其作比對，所獲血流血氧參數(shù)值都為相對變化值，避免動物實驗中由于探頭位置和光強等造成的差異性。

2 動物準備與實驗過程

2.1 實驗動物

實驗采用ICR（Institute of cancer research，美國國立癌癥研究所）型雌性小鼠（購買于青龍山動物實驗中心，中國南京），在小鼠出生約8 周后，將小鼠飼養(yǎng)與恒溫（25±1 ℃）和恒濕（55±10%）的飼養(yǎng)籠中，晝夜間隔12 h，連續(xù)飼養(yǎng)7 d，在這個過程中保證水和食物供應(yīng)充足。所有的動物實驗程序均按照南京航空航天大學動物保護與倫理協(xié)議的要求進行。

5% 水合氯醛（400 mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠，并將其置于立體定向定位儀上，酒精消毒皮膚后，切開腦皮層，清潔顱骨表面，并分別在同側(cè)腦區(qū)顱骨鉆孔。右側(cè)孔的中心為前鹵前0.5 mm，距離中線1.0 mm，用來進行近紅外光譜血氧采集實驗，同側(cè)的中心為前鹵后約為0.5 mm，中線外側(cè)約1.0 mm，成像面積大約2 mm2，用來進行激光散斑血流成像實驗。

2.2 實驗過程

將32 只實驗小鼠隨機分為4 組，每組8 只，分別為LPS 組、高滲鹽水治療組、甘露醇治療組和生理鹽水對照組。本實驗中，LPS 的劑量采用10 ml/kg 的注射量，所有小鼠在LPS 用藥2 h 后分別對治療組和對照組注射7.5%高滲鹽水（4 ml/kg），20% 甘露醇（2 g/kg）以及0.9% 生理鹽水（6 ml/kg）。所有給藥方式均采用腹腔注射。然后用激光照射在小鼠左側(cè)腦區(qū)用于激光散斑血流成像實驗，同時光纖探針被插入到小鼠的同側(cè)腦區(qū)用于近紅外光譜實驗，實驗分組和過程如圖3 所示。

圖3 實驗分組和過程Fig.3 Experimental grouping and process

實驗組別的3 組在LPS 試劑注射后，利用激光散斑成像系統(tǒng)和光譜分析系統(tǒng)分別同時采集小鼠的血流和血氧信息，間隔20 min 記錄一次，總計2 h，之后分別對治療組和對照組注射高滲鹽水和甘露醇以及0.9%生理鹽水，間隔20 min 記錄一次，記錄1 h。對照組在同一時刻注射生理鹽水。

3 小鼠腦損傷模型在體實驗

3.1 脂多糖腦損傷實驗

用光纖采集小鼠的血氧值，深度為距離腦膜0~2 mm 的范圍，同時用激光散斑獲取血流的偽彩圖像，散斑成像位置和光纖探頭位置見2.1。將LPS 組和對照組的8 只小鼠的光譜和激光散斑實驗結(jié)果分別取均值，得到腦血氧（SO2）與ROI 的腦血流（rCBF）的變化圖，如圖4 所示。

圖4 脂多糖組和對照組的血流血氧變化曲線Fig.4 Changes of blood flow and blood oxygen saturation for LPS and control groups

實驗發(fā)現(xiàn)，在3 個小時的實驗過程中，對照組小鼠腦血氧有輕度下降，但下降程度保持在正常范圍內(nèi)，這可能是因為隨著實驗進行小鼠生命體征逐漸下降造成的。分析LPS 組實驗結(jié)果，在LPS 注射后小鼠ROI 區(qū)域的rCBF 值呈現(xiàn)增加趨勢；至180 minLPS 組rCBF 值達到1.36±0.080，對照組rCBF 為1.09±0.075。此外，血氧的變化曲線呈現(xiàn)大幅度下降的趨勢，至180 min SO2降至0.62±0.021，低于對照組0.75±0.019，說明LPS 會降低小鼠體內(nèi)血紅蛋白與氧氣結(jié)合的能力，造成SO2降低。在LPS 和對照組的血流和血氧實驗中，LPS 和對照組具有明顯意義（P<0.05）。

3.2 脂多糖腦損傷治療實驗

圖5 所示為甘露醇、高滲鹽水和LPS 組的治療評估實驗結(jié)果。通過將各組平均值比較，評估甘露醇和高滲鹽水的治療效果，分析兩種藥物治療效果的一致性和差異性。如圖5 所示，在200 min 時，甘露醇組和高滲鹽水組的rCBF 與LPS 組的rCBF 相比，具有顯著差異性（P<0.05）；同時，甘露醇組、高滲鹽水組的SO2也和LPS 組的SO2具有差異性，呈現(xiàn)統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

實驗證明，在LPS 注射2 h 后，分別對小鼠注射高滲鹽水和甘露醇以及生理鹽水（圖5 中虛線處），高滲鹽水組和甘露醇組小鼠的rCBF 和SO2明顯得到改善，具體表現(xiàn)為血流速度的降低與血氧含量的升高，說明高滲鹽水和甘露醇都起到了對LPS 引起的腦損傷的治療作用，能夠改善血液循環(huán)，提高血氧含量。 并且，比較180 min 的甘露醇組和高滲鹽水組兩組rCBF 和SO2（甘露醇組：1.182±0.098、0.71±0.023；高滲鹽水組：1.216±0.106、0.69±0.024），發(fā)現(xiàn)高滲鹽水的治療效果略優(yōu)于甘露醇，說明高滲鹽水在治療LPS 引起的腦水腫損傷模型中能夠發(fā)揮更好的作用。

圖5 高滲鹽水和甘露醇分別治療后血流和血氧變化曲線Fig.5 Changes of blood flow and blood oxygen saturation after hypertonic saline and mannitol treatment

3.3 相關(guān)性分析

分析不同組別之間的血流和血氧兩個參數(shù)的相關(guān)性信息，如圖6 所示。相關(guān)性分析結(jié)果表明，血流和血氧的變化呈現(xiàn)負相關(guān)趨勢。高滲鹽水組、甘露醇組、LPS 組和對照組的血流和血氧進行皮爾森偏相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)對照組的R2為0.892 1，說明線性相關(guān)程度較高，其次是甘露醇組和高滲鹽水組；而LPS 組的R2為0.567 2，說明線性相關(guān)程度較低，表明LPS 誘導腦損傷后的血流血氧關(guān)聯(lián)性會隨時間改變，并且120 min 后的血氧值大概降低到0.62，血流值逐漸升高到基準值的1.4，說明腦損傷程度加重。與此同時，將甘露醇組和高滲鹽水組與LPS 組做對比，發(fā)現(xiàn)兩組R2分別為為0.745 和0.719 5，說明相較于LPS 組的不治療，通過高滲鹽水和甘露醇的治療，的確改善了血流血氧的相關(guān)性。

圖6 血流和血氧相關(guān)性分析結(jié)果Fig.6 Correlation analysis of blood flow and blood oxygen saturation

4 討 論

本研究提出了一種較為創(chuàng)新的方法，將激光散斑血流成像系統(tǒng)和光譜血氧分析聯(lián)合系統(tǒng)用于LPS誘導的小鼠腦損傷模型中。首先進行了脂多糖組和對照組的在體腦血流和腦血氧實驗，分析實驗結(jié)果說明了脂多糖引起小鼠腦損傷后造成血流和血氧的相應(yīng)變化情況，進一步說明了脂多糖的藥物功效。其次本研究綜合分析了7.5% 的高滲鈉和20% 的甘露醇對脂多糖用藥后的治療效果，對多組實驗結(jié)果進行取均值和歸一化等處理，使實驗結(jié)果更加精確有說服力，通過與對照組的實驗數(shù)據(jù)進行量化分析，發(fā)現(xiàn)兩者均具有明顯改善脂多糖引發(fā)的小鼠血流和血氧的非正常變化，同時表明7.5% 的高滲鈉對小鼠腦損傷的治療效果明顯優(yōu)于20% 的甘露醇。這為臨床應(yīng)用和科學研究提供了進一步的實驗依據(jù)。

本研究只進行了3 h 的實驗過程，后續(xù)還可以繼續(xù)深入研究較長時間實驗過程中小鼠的血流血氧變化情況。本研究利用激光散斑血流成像系統(tǒng)和光譜血氧分析系統(tǒng)進行聯(lián)合實驗，進一步驗證了系統(tǒng)的有效性和準確性，為LPS 誘導小鼠腦損傷引起的生理參數(shù)變化提供了新的研究思路和實驗方法。此次研究利用激光散斑和光譜兩套分析系統(tǒng)，后面的實驗中還可以考慮激光散斑成像系統(tǒng)和電生理系統(tǒng)或光譜分析系統(tǒng)和電生理系統(tǒng)的聯(lián)合測量系統(tǒng)用于LPS 或其他藥物實驗，可以實現(xiàn)3 個系統(tǒng)對LPS 等腦損傷藥物的聯(lián)合監(jiān)測與分析。

5 結(jié)束語

研究發(fā)現(xiàn)，LPS 作用3 h 后，LPS 組的rCBF 升高到1.36±0.080，SO2降低到0.62±0.021，與對照組相比較，引起了小鼠腦血流的升高、腦血氧的降低，兩者呈現(xiàn)相反的單向變化規(guī)律。采用高滲鹽水和甘露醇對腦損傷模型進行治療，高滲鹽水和甘露醇治療后的rCBF 分別恢復到1.182±0.098、1.216±0.106，SO2分別恢復到0.71±0.023、0.69±0.024，血流量降低和血氧含量升高說明兩種藥物改善了小鼠的血腦循環(huán)代謝，說明高滲鹽水和甘露醇對LPS 誘導的腦損傷具有一定的治療作用。將高滲鹽水和甘露醇單獨作比較，結(jié)果顯示高滲鹽水治療后血流和血氧的變化曲線更加明顯，進一步說明高滲鹽水相比甘露醇對LPS 具有更好的治療效果。

本研究通過聯(lián)合光譜分析和激光散斑成像系統(tǒng)實時同步檢測，充分驗證了兩個系統(tǒng)的有效性，為LPS 用藥后引起機體血流和血氧變化的研究奠定了基礎(chǔ)，同時在科學研究、藥物治療和臨床應(yīng)用等方面具有重要的意義和價值。