劉曉瓊，李志茹，胡 賓，沈敬華

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010059；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）易引起多關(guān)節(jié)炎癥，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起關(guān)節(jié)畸形，甚至功能喪失[1]。近年來，越來越多研究表明RA與免疫反應(yīng)失衡有關(guān)[2]，RA免疫反應(yīng)同細(xì)胞因子相關(guān)，細(xì)胞因子釋放過量會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞活化過度[3]。目前最受關(guān)注的調(diào)節(jié)分子是CTLA-4、PD-1。T淋巴細(xì)胞活化后，快速表達(dá)T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（CTLA-4），CTLA-4可以同CD28競爭性結(jié)合B7-1/B7-2，以下調(diào)免疫應(yīng)答，從而限制T細(xì)胞增殖，使效應(yīng)T細(xì)胞失活，達(dá)到免疫平衡恢復(fù)[4]。關(guān)于RA相關(guān)的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的研究為RA的治療提供了指導(dǎo)[5]。目前，市面上常用的治療RA藥物具有一定副作用，而免疫抑制劑由于經(jīng)濟(jì)和自身免疫耐受的影響，也限制了其臨床應(yīng)用[6]。

蒙藥西拉.森登（Xira.Sendeng）-4又稱蒙藥四味文冠木湯，是抗風(fēng)濕的經(jīng)典藥方，在《中華人民共和國藥典蒙藥分冊》中記載，由文冠木、川楝子、訶子、梔子（以5：3：1：1比例）構(gòu)成，具有清熱、消腫、燥協(xié)日烏素等作用[7，8]。森登-4在實(shí)驗(yàn)中不僅被證實(shí)可以調(diào)節(jié)免疫平衡以治療CIA[9]，而且在臨床RA治療中有一定療效[10，11]。本研究利用大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型（CIA），觀察森登-4治療后IL-6、TGF-β、sCTLA-4和B7-1（sCD80）的水平，探究森登-4對CTLA-4/B7-1介導(dǎo)的免疫炎癥相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠48只，雄性和雌性各24只，4.5～5.5周齡，體質(zhì)量約168 g，購于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，合格證號：SCXK（蒙）2015-0001。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，室溫21℃～24℃。實(shí)驗(yàn)過程對大鼠的處理符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，已通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

藥名甲氨喋呤片森登-4湯廠家上藥信宜平內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院批號H31020644 20190802

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

試劑名牛II型膠原蛋白弗氏完全佐劑硝酸甲醛乙酸IL-6 ELISA試劑盒TGF-βELISA試劑盒sCTLA-4 ELISA試劑盒sCD80 ELISA試劑盒抗CTLA-4抗體抗CD80抗體中性樹膠蘇木染色液95%酒精PBS磷酸鹽緩沖液伊紅通用型SP kit DAB kit廠家索萊寶公司Sigma公司北京化工廠風(fēng)船化學(xué)麥克林公司睿信生物睿信生物睿信生物睿信生物博士德生物博士德生物中衫金橋中衫金橋文水大有中衫金橋青藥生物中衫金橋中衫金橋批號Lot.No.809L051 F5881，1002804381 20170728 20190826 A801299 20191125003 20191125003 20191125003 20191125003 ZP7611BP11 ES092BP92F ZLI-9555 ZLI-9609 20191015 ZLI-9061 HB0107 SP-9000 ZLI-9017

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

名稱游標(biāo)卡尺電子秤動(dòng)物DR脫水機(jī)平衡離心機(jī)石蠟切片機(jī)烤片機(jī)冰臺石蠟包埋機(jī)全波段酶標(biāo)儀顯微鏡水浴鍋廠家或型號上海工量具有限公司SD168 CLEAVET.DR16 Thermo,EXCELSIOR AS湘儀離心機(jī)儀器RM2235 HI1210 Histolo Arcadiac Arcadia H Thermo，1510 Leica,DM3000 HWS-12

1.5 動(dòng)物造模及給藥

48只大鼠被隨機(jī)分為6組：正常組，模型組，森登-4低、中、高劑量組和甲氨蝶呤組，每組8只。牛II型膠原蛋白溶入0.1 mmol/L醋酸，冷藏24 h；次日溶于等容積完全弗氏佐劑中，冰浴下充分混合乳化，混合液濃度為0.1 mg/L。在大鼠背部和尾根近1cm處酒精消毒后注射抗原；正常組被注射等容積生理鹽水。7天后，采用上述方法加強(qiáng)免疫。造模后，森登-4低、中、高劑量組分別予1.0 g/（kg?d），2.0 g/（kg?d），4.0 g/（kg?d）熱水混勻后灌胃；甲氨蝶呤組予1.0 mg/（kg?w）灌胃；正常組和模型組予等容積生理鹽水灌胃，每天定時(shí)操作，療程為3個(gè)，共27天。造模期間每天觀察大鼠活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度，記錄攝食情況、體重和右后足足爪厚度，并對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)進(jìn)行評分，關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分（見表1）。

表1 關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評分標(biāo)準(zhǔn)

1.6 ELISA法檢測血清IL-6、TGF-β、sCTLA-4、sB7-1（CD80）水平

治療3個(gè)療程后，隨即用10%水合氯醛0.3 mL/100g對大鼠行腹腔麻醉，取4～5 mL腹主動(dòng)脈血，置于離心管中標(biāo)記離心，離心后取其上清于EP管內(nèi)，EP管編號放入冰箱保存，待檢。根據(jù)試劑說明步驟操作，檢測吸光度值，分別計(jì)算濃度。

1.7 HE染色

取血后處死大鼠，取大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)，編號標(biāo)記放標(biāo)本盒中，固定于4%甲醛溶液中24 h，14%硝酸避光脫鈣72 h（用蒸餾水344 mL，將56 mL硝酸不斷攪拌緩慢加入蒸餾水中，最終體積為400 mL）。脫鈣后縱向分離踝關(guān)節(jié)，最后制備蠟塊、切片、HE染色，顯微鏡下采圖、讀片。病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)（見表2）。

表2 踝關(guān)節(jié)病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

1.8 免疫組化法檢測踝關(guān)節(jié)CTLA-4、B7-1的表達(dá)

利用免疫組化法分別檢測抗體CTLA-4、CD80（B7-1）在大鼠踝關(guān)節(jié)的表達(dá)情況，實(shí)際操作步驟根據(jù)試劑說明進(jìn)行，最終在顯微鏡下讀片，分別計(jì)算兩種抗體的IOD值。

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 23.0軟件分析數(shù)據(jù)，使用單因素方差分析法分析，采用LSD法或Dunnett T3法進(jìn)行兩兩檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，所得結(jié)果P＜0.05，則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

造模成功后，除外正常組，各造模組大鼠均出現(xiàn)活動(dòng)減少、后肢腫脹明顯、精神萎靡、毛發(fā)缺少光澤等情況。如表3所示，經(jīng)治療后，高劑量森登-4和甲氨喋呤可緩解以上癥狀。模型組造模后第14天有體重的明顯降低（P＜0.05）；3療程后，各藥物治療組比模型組的體重顯著升高（P＜0.05）。

表3 大鼠體重變化觀察（±s，n=8）(g)

表3 大鼠體重變化觀察（±s，n=8）(g)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較ΔP＜0.05。

分組正常組模型組森登-4低劑量組森登-4中劑量組森登-4高劑量組甲氨喋呤組造模前175.63±7.596 172.75±9.721 173.13±10.021 171.38±9.812 176.75±4.862 174.88±9.819造模后7日192.38±6.046 180.25±8.548*182.25±16.464 181.50±14.639 181.75±10.166 184.50±6.256造模后14日220.88±12.563 190.00±10.542*192.75±15.773*197.50±19.574*201.00±14.995*200.75±11.973*3療程結(jié)束260.25±13.477 210.50±13.617*225.75±17.597*Δ 235.13±11.606*Δ 249.25±11.094Δ 250.75±15.490Δ

如表4所示，同正常組相比，模型組造模后第14天時(shí)足掌厚度明顯增厚（P＜0.05）；治療3療程后，同模型組相比，藥物治療組足掌厚度明顯降低（P＜0.05）。

表4 蒙藥森登-4治療針對對大鼠足掌厚度的影響（±s，n=8）(mm)

表4 蒙藥森登-4治療針對對大鼠足掌厚度的影響（±s，n=8）(mm)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較ΔP＜0.05。

分組正常組模型組森登-4低劑量組森登-4中劑量組森登-4高劑量組甲氨喋呤組造模前3.15±0.045 3.16±0.038 3.17±0.041 3.14±0.060 3.18±0.039 3.19±0.066造模后第14天4.02±0.029 6.19±0.033*6.18±0.040*6.16±0.053*6.14±0.039*6.15±0.065*3療程結(jié)束4.44±0.146 7.83±0.342*5.84±0.261*Δ 5.45±0.283*Δ 4.69±0.249Δ 4.65±0.201Δ

2.2 森登-4對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)影響

如表5所示，各造模組和正常組比較，在造模后第7天和第14天時(shí)AI明顯升高（P＜0.05）；經(jīng)過治療3療程后，藥物治療組AI比模型組降低，森登-4高劑量組和甲氨喋呤組緩解最明顯（P＜0.05）。

表5 森登-4治療對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響（±s，n=8）

表5 森登-4治療對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響（±s，n=8）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較ΔP＜0.05。

分組正常組模型組森登-4低劑量組森登-4中劑量組森登-4高劑量組甲氨喋呤組造模后7天0.00±0.000 5.53±0.331*5.42±0.305*5.44±0.251*5.48±0.357*5.46±0.259*Δ造模后第14天0.00±0.000 8.50±0.269*7.78±0.788*7.84±0.767*8.20±0.223*8.43±0.223*Δ 3療程結(jié)束0.00±0.000 10.14±0.336*6.04±0.336*Δ 5.54±0.336*Δ 4.28±0.616*Δ 4.04±0.440*Δ

2.3 森登-4對關(guān)節(jié)HE病理改變的影響

如表6、圖1所示，3個(gè)療程后，對比各組HE切片發(fā)現(xiàn)，造模大鼠的滑膜組織炎細(xì)胞浸潤、纖維組織和滑膜組織增生均有顯著升高（P＜0.05）；3療程藥物治療后，治療組比模型組的滑膜炎細(xì)胞浸潤、滑膜組織和纖維組織增生評分則顯著降低（P＜0.05）。森登-4高劑量組和甲氨蝶呤組變化最明顯。

圖1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色圖片（×200）

表6 蒙藥森登-4治療針對大鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)評分的影響（±s，n=8）

表6 蒙藥森登-4治療針對大鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)評分的影響（±s，n=8）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較ΔP＜0.05。

分組正常組模型組森登-4低劑量組森登-4中劑量組森登-4高劑量組甲氨喋呤組滑膜細(xì)胞增生0.00±0.000 2.75±0.707*1.63±0.518*Δ 1.50±0.535*Δ 1.38±0.744*Δ 1.25±0.707*Δ炎細(xì)胞浸潤0.00±0.000 3.00±0.758*1.63±0.744*Δ 1.50±0.756*Δ 1.25±0.463*Δ 1.13±0.641*Δ纖維組織增生0.00±0.000 2.75±0.463*1.50±0.756*Δ 1.38±0.518*Δ 1.25±0.463*Δ 1.13±0.641*Δ

2.4 大鼠血清中IL-6、TGF-β、sCTLA-4和sB7-1（CD80）的水平

如表7所示，模型組IL-6、sCTLA-4的表達(dá)水平比正常組顯著升高（P＜0.05）；3個(gè)療程藥物治療后，各治療組IL-6、sCTLA-4水平則比模型組明顯降低（P＜0.05）。模型組TGF-β、B7-1濃度比正常組明顯減少（P＜0.05）；而3個(gè)療程藥物治療后，各治療組則比模型組顯著上調(diào)（P＜0.05）。其中治療組森登-4高劑量組和甲氨蝶呤組表現(xiàn)尤為突出。以上結(jié)果說明森登-4和甲氨喋呤通過上調(diào)抑炎因子、下調(diào)促炎因子的水平緩解CIA大鼠的病情，并且治療效果同藥物劑量相關(guān)，呈劑量反應(yīng)關(guān)系。

表7 大鼠血清IL-6、TGF-β、sCTLA-4和sB7-1(CD80)變化（±s，n=8）（pg/ml）

表7 大鼠血清IL-6、TGF-β、sCTLA-4和sB7-1(CD80)變化（±s，n=8）（pg/ml）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較ΔP＜0.05。

分組正常組模型組森登-4低劑量組森登-4中劑量組森登-4高劑量組甲氨喋呤組IL-6 47.00±2.016 105.66±15.441*78.24±13.191*Δ 74.71±10.916*Δ 71.02±8.422*Δ 71.64±9.048*Δ TGF-β 84.09±10.065 42.89±12.538*69.82±16.66Δ 72.94±17.219Δ 80.25±23.455Δ 78.25±16.701Δ sCTLA-4 138.57±25.708 374.84±44.600*275.48±24.592*Δ 245.82±26.713*Δ 209.57±20.760*Δ 195.90±24.216*Δ B7-1 284.12±30.861 135.45±32.104*200.13±15.376*Δ 220.14±26.648*Δ 255.20±26.648*Δ 260.82±29.312Δ

2.5 免疫組化法檢測CTLA-4和B7-1表達(dá)水平

如表8、圖2所示，3個(gè)療程后，模型組CTLA-4 IOD比正常組顯著降低（P＜0.05）；各藥物治療組CTLA-4 IOD值比模型組顯著提高（P＜0.05），呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。這說明藥物治療幫助CTLA-4表達(dá)增強(qiáng)，抑制炎性反應(yīng)，且同藥物劑量有關(guān)。

圖2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)CTLA-4的免疫組化圖片（×200）

表8 各組大鼠踝關(guān)節(jié)CTLA-4表達(dá)水平（±s，n=8）

表8 各組大鼠踝關(guān)節(jié)CTLA-4表達(dá)水平（±s，n=8）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較ΔP＜0.05。

分組正常組模型組森登-4低劑量組森登-4中劑量組森登-4高劑量組甲氨喋呤組CTLA-4 IOD 4258.95±315.078 2180.85±163.786*Δ 5089.93±575.053*Δ 6099.26±599.169*Δ 7315.98±794.078*Δ 7170.33±221.482*Δ

如表9，圖3所示，模型組B7-1 IOD值比正常組顯著升高（P＜0.05）；3療程藥物治療后，各治療組B7-1 IOD值比模型組顯著降低（P＜0.05），同樣呈劑量反應(yīng)關(guān)系。

圖3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)CD80免疫組化圖片（×200）

表9 各組大鼠踝關(guān)節(jié)B7-1的表達(dá)水平（±s，n=8）

表9 各組大鼠踝關(guān)節(jié)B7-1的表達(dá)水平（±s，n=8）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較ΔP＜0.05。

分組正常組模型組森登-4低劑量組森登-4中劑量組森登-4高劑量組甲氨喋呤組CD80 IOD 2500.95±511.428 8000.68±1567.362*5500.56±564.472*Δ 5000.37±452.291*Δ 4200.32±976.382*Δ 4000.00±774.647*Δ

3 討論

RA是一類全身性自身免疫疾病，其病理特點(diǎn)主要為關(guān)節(jié)滑膜炎及慢性血管翳的形成，滑膜炎的慢性長期存在對關(guān)節(jié)軟骨和骨有持續(xù)破壞，最終造成關(guān)節(jié)畸形、喪失正常功能。RA涉及的炎性因子主要有IL-6、TGF-β等，目前中藥及蒙藥尤其是森登-4在臨床上治療RA療效確切且有著重大前景，其由森登（文冠木）、川楝子、訶子、梔子四類具有清熱、止痛、消腫的藥物組成，具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，但具體的機(jī)制尚未完全明確。

CTLA-4是免疫平衡的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子。近年來研究發(fā)現(xiàn)CTLA-4同CD28競爭性結(jié)合B7-1/B7-2（CD80/CD86），以啟動(dòng)抑制信號，限制T細(xì)胞增殖，使效應(yīng)T細(xì)胞失活，免疫應(yīng)答恢復(fù)平衡。但CTLA-4/B7-1的結(jié)合更穩(wěn)定，且具有抑制淋巴細(xì)胞增殖的作用，而B7-2無此作用。RA患者的CTLA-4/CD28失衡是RA的一種致病機(jī)制[14]。CTLA-4能夠有效抑制RA患者關(guān)節(jié)破骨細(xì)胞的分化，減少骨破壞[15]，抑制B細(xì)胞中B7-1/B7-2的表達(dá)，降低IL-6和TNF-α水平，起到免疫抑制作用。這表明CTLA-4可能通過抑制T、B細(xì)胞激活治療RA。

本研究發(fā)現(xiàn)各治療組大鼠炎細(xì)胞浸潤、滑膜細(xì)胞增生的病理學(xué)評分和血清IL-6、sCTLA-4的水平較模型組均有下調(diào)，其中甲氨喋呤組和森登-4高劑量組下降程度最高；而各治療組血清中抑炎因子TGF-β、sCD80（B7-1）的水平較模型組有不同程度的升高，最為明顯的是森登-4高劑量組和甲氨喋呤組；提示森登-4治療RA主要通過抑制炎癥發(fā)揮作用，且療效與劑量相關(guān)，這與森登-4成方中的藥物多具有清熱、止痛、消腫作用有關(guān)。徐曉艷等研究森登-4治療RA從血管生成方面及炎癥方面的結(jié)果同樣提示了其重要的炎癥抑制作用，同我們的研究結(jié)果一致，但本研究森登-4的劑量更為細(xì)化，可為將來藥物研制提供重要理論數(shù)據(jù)。

本研究進(jìn)一步的大鼠踝關(guān)節(jié)CTLA-4、B7-1免疫組化法結(jié)果顯示，各劑量森登-4和甲氨喋呤組CTLA-4的表達(dá)有不同程度的上調(diào)，而各治療組踝關(guān)節(jié)B7-1的表達(dá)則下調(diào)，說明蒙藥森登-4通過CTLA-4/B7-1的負(fù)性信號通路實(shí)現(xiàn)對CIA大鼠關(guān)節(jié)炎反應(yīng)有明顯抑制作用。高劑量森登-4與甲氨喋呤治療效果相似，但介于甲氨喋呤有著重要的致肝肺纖維化的副作用，且藥物極量有限，且其他治療RA的藥物較為昂貴，加重患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。森登-4是一類安全經(jīng)濟(jì)的治療藥物。

綜上，蒙藥森登-4在RA中有著重要的治療價(jià)值和研究前景，但本研究尚為基礎(chǔ)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，需進(jìn)一步的人體及相關(guān)組織學(xué)研究乃至更重要的臨床研究去確證。且蒙藥目前尚有一些不足之處，今后需要對森登-4的有效成分進(jìn)行進(jìn)一步提煉甚至研究成為更為方便應(yīng)用的劑型，是今后的研究重點(diǎn)。本研究為森登-4治療RA提供了新的思路和方向。