趙鵬飛，馬雪英，孫振婷，高 陽，喬鵬飛*

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院影像診斷科，內(nèi)蒙古 呼和浩特010050）

1 引言

原發(fā)性癲癇主要發(fā)生于兒童和年輕人，患者腦部無明顯器質(zhì)性改變，發(fā)作又具有不定時性和短暫性，在臨床診治和病理研究方面均面臨較大的挑戰(zhàn)[1]。目前臨床上用于癲癇診斷的主要方法有腦電圖（electroencephalogram，EEG）、正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像（positron emission computed tomography，PET）、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像（single photon emission computed tomography，SPECT）及磁共振顯像（magnetic resonance imaging，MRI）等。用于常規(guī)檢查的EEG在癲癇發(fā)作期敏感性較高，但非發(fā)作期的診斷價(jià)值大打折扣[2，3]，PET與SPECT費(fèi)用昂貴不宜普及，近年來MRI在方法學(xué)方面取得了極大的進(jìn)展，相繼出現(xiàn)的軸位彌散加權(quán)成像（diffusion weigh imagin，DWI）、體素內(nèi)不相干運(yùn)動擴(kuò)散成像（introvoxel incoherent movement，IVIM）及彌散峰度成像（diffusion kurtosis imaging，DKI）技術(shù)，更是實(shí)現(xiàn)了從宏觀影像學(xué)到微觀影像學(xué)乃至功能評估的跨越[4～6]。在這些新技術(shù)的基礎(chǔ)上，我們嘗試采用擴(kuò)散成像MRI評估癲癇的發(fā)生與發(fā)展，考慮到人類原發(fā)性癲癇無法獲取病變組織的病理資料，本研究應(yīng)用大鼠模型分析癲癇磁共振特征與病理改變的關(guān)系，為深入分析其應(yīng)用價(jià)值提供數(shù)據(jù)支撐，并間接為臨床診斷、評估、治療癲癇提供了功能磁共振方面的支撐。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

實(shí)驗(yàn)動物為80只6～8周齡健康清潔級Wistar大鼠，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供（許可證號：SCXK（滬）2019-1106），雌雄各半。所有動物按照體重由低到高編號，采用隨機(jī)數(shù)字表分為兩組，空白對照組和癲癇模型組各40只。

2.2 模型制備與評價(jià)

空白對照組正常飼養(yǎng)，癲癇模型組采用腹腔注射海仁酸（10mg/支，購自Sigma官網(wǎng)）的方式制備癲癇模型。本研究在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用梯度劑量法確立了該模型的最佳海仁酸用量為6 mg/kg，以生理鹽水配置為1 mg/mL的溶液，根據(jù)大鼠體重給藥，比如200 g大鼠給藥量為（6mg/kg×0.2kg）1mg/mL=1.2 mL。在腹腔注射后30 min開始觀察大鼠行為，發(fā)生前驅(qū)癥狀且腦電圖呈現(xiàn)典型癲癰樣放電為模型制備成功[7]。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（S.2019014）。模型制備成功后根據(jù)Racine量表進(jìn)行評級，由輕至重將癲癇行為評為0～V級，0級：完全正常，I級：咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉抽搐，II級：以點(diǎn)頭運(yùn)動為主的頸部肌肉的抽搐，III級：單側(cè)前肢的陣攣、抽搐IV：雙側(cè)前肢陣攣、抽搐伴身體立起，V級：雙側(cè)后肢強(qiáng)直、身體背曲強(qiáng)直、跌倒。

2.3 大鼠MRI掃描方法

于致病后3天進(jìn)行MRI檢查。主要步驟：10%的水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射麻醉，采用美國GE公司的Discovery MR750 3.0T超導(dǎo)型磁共振掃描儀進(jìn)行MRI檢查，將大鼠固定于四通道老鼠腦部核磁共振線圈，檢查序列包括矢狀面T2WI、FLAIR，冠狀面T1WI、T2WI、DWI、DKI、IVIM序列。DKI序列采集0 s/mm2～2500 s/mm2范圍內(nèi)的6個b值，25個擴(kuò)散敏感梯度方向；IVIM序列采集0 s/mm2～200 s/mm2范圍內(nèi)的11個b值和700 s/mm2～1300 s/mm2范圍內(nèi)的3個b值，層厚2.9mm，層間隔0mm。所得圖像數(shù)據(jù)傳輸至工作站，運(yùn)用MRIcro軟件勾畫ROI并進(jìn)行測量，ROI包括灰質(zhì)內(nèi)12個腦區(qū)：雙側(cè)基底節(jié)區(qū)、海馬、杏仁核海馬區(qū)、顳葉皮層、頂葉皮層、額葉皮層，白質(zhì)內(nèi)5個腦區(qū)：雙側(cè)外囊區(qū)、雙側(cè)前聯(lián)合區(qū)域及胼胝體，每個腦區(qū)ROI測3次，每個ROI控制在4個體素左右，取平均值，分別測量其平均峰度（mean kurtosis，MK）值、各向平均擴(kuò)散率（mean diffusion rate，MD）值、部分各向異性（fractional anisotropy，F(xiàn)A）值、真性水分子擴(kuò)散系數(shù)（diffusion coefficient，D）、微循環(huán)灌注系數(shù)（microcirculation perfusion coefficient，D*）和灌注分?jǐn)?shù)（perfusion fraction，f），然后計(jì)算出每個腦區(qū)各參數(shù)的均值。

2.4 大鼠病理評估方法

本研究中40只用于模型制備的大鼠共獲得成功模型28只（成功率70.0%，癲癇模型組），于致病后3天、1、3、5周[8]。隨機(jī)取7只大鼠，空白對照組同期隨機(jī)取10只大鼠，斷頭，取出全腦組織，生理鹽水沖洗干凈，浸泡于4%的多聚甲醛浸泡過夜，次日進(jìn)行石蠟包埋制備常規(guī)病理切片，HE染色觀察病理形態(tài)的變化，并采用Tunel染色實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞凋亡率，主要步驟：磷酸鹽（PBS）緩沖液沖洗4次，每次5min，避光操作，先加入封閉液200 μL孵育10min；再次PBS緩沖液沖洗，加入透化溶液孵育5min；再次PBS緩沖液沖洗，避光配置tunel溶液并滴加在每個切片后，避光孵育60min。電子顯微鏡下觀察，死亡細(xì)胞被染成棕色或棕黃色，計(jì)算死亡細(xì)胞比例。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)；先行正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)，F(xiàn)A值、MD值、MK值符合正態(tài)分布，以均數(shù)（χ）±標(biāo)準(zhǔn)差（S）表示；兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多個時間點(diǎn)的組間比較屬于重復(fù)測量數(shù)據(jù)，行重復(fù)測量的方差分析及事后LSD、SNK檢驗(yàn)；D*值、D值、f值均不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)（M）±四分位數(shù)間距（Q）表示，組間比較行Mann-Whitney U檢驗(yàn)。FA值、MD值、MK值、D*值、D值、f值與癲癇程度的相關(guān)性分析行Spearman相關(guān)（秩相關(guān)），與神經(jīng)元凋亡率的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)（簡單線性相關(guān)）；檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 空白對照組與癲癇模型組大鼠的擴(kuò)散成像MRI參數(shù)比較

經(jīng)觀察，大鼠在致病3周時擴(kuò)散成像MRI參數(shù)變化最為明顯，因此我們主要統(tǒng)計(jì)該時間點(diǎn)的MRI參數(shù)差異。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，癲癇模型大鼠的MRI參數(shù)組間差異最為顯著的是海馬區(qū)、丘腦及顳葉白質(zhì)的MK值、D值及f值，癲癇模型組的MK值偏大，D值和f值偏小，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。除此以外，癲癇模型組的海馬區(qū)和丘腦區(qū)D*值也明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表1、圖1）。

圖1 a:癲癇模型組MK值偽彩圖；b:癲癇模型組D值偽彩圖；c：癲癇模型組f值偽彩圖Fig.1 a:False color map of MK value in epilepsy model group;b:D-value pseudo color map in epilepsy model group;c:F-value pseudo color map of epilepsy model group

表1 癲癇模型組與空白對照組大鼠的擴(kuò)散成像MRI參數(shù)比較Tab.1 Comparison of MRI parameters of diffusion imaging between epilepsy model group and blank control group

3.2 空白對照組與癲癇模型組大鼠的病理比較

HE染色后觀察大鼠腦組織病理形態(tài)（見圖2），正常對照組大鼠腦組織細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，癲癇模型組大鼠腦組織發(fā)現(xiàn)明顯的神經(jīng)元壞死，空泡變性，核仁消失，部分可見淋巴細(xì)胞浸潤。TUNEL染色后觀察大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率（見圖3），癲癇模型組致病后3d、1、3、5周的神經(jīng)元凋亡率均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表2）。

表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)神經(jīng)元凋亡率比較Tab.2 Comparison of neuronal apoptosis rate at different time points in each group of rats

圖2 兩組大鼠不同時間點(diǎn)腦組織切片HE染色特征比較（10x）Fig.2 Comparison of HE staining characteristics of brain tissue sections at different time points between the two groups(10x)

圖3 兩組大鼠不同時間點(diǎn)腦組織切片TENEL染色結(jié)果比較（10x）Fig.3 Comparison of tenel staining results of brain tissue sections at different time points between the two groups(10x)

3.3 擴(kuò)散成像MRI參數(shù)與大鼠病理特征的關(guān)系

將病理嚴(yán)重程度分為輕度、中度與重度，采用Spearman檢驗(yàn)分析各個參數(shù)與大鼠病理嚴(yán)重程度的關(guān)系，采用Pearson檢驗(yàn)分析各個參數(shù)與大鼠神經(jīng)元凋亡率的關(guān)系，結(jié)果如表3所示，癲癇大鼠海馬區(qū)、丘腦及顳葉白質(zhì)的MK值和病理嚴(yán)重程度（ρ=0.665-0.778）、神經(jīng)元凋亡率（r=0.675-0.705）呈正相關(guān)性（P均<0.001），D值及f值與與病理嚴(yán)重程度（ρ=0.454-0.701）、神經(jīng)元凋亡率（r=0.554-0.714）呈負(fù)相關(guān)性（P均<0.001）。

表3 癲癇大鼠病理嚴(yán)重程度及神經(jīng)元凋亡率與各個MRI參數(shù)之間的相關(guān)性分析結(jié)果Tab.3 Correlation analysis results between the pathological severity and neuronal apoptosis rate of epileptic rats and various MRI parameters

4 討論

癲癇的臨床診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、神經(jīng)電生理學(xué)以及影像學(xué)檢查，原發(fā)性癲癇缺乏明顯的器質(zhì)性改變，在病理研究方面受到較大的限制。擴(kuò)散成像MRI是指將多種MRI方法聯(lián)合用于疾病診斷與評估，在近幾年的技術(shù)發(fā)展中，MRI通過不同的掃描與影像重建模式，逐漸實(shí)現(xiàn)了對組織微觀結(jié)構(gòu)改變的觀察和對局部功能異常的評估，這對甄別癲癇的病理研究具有重要意義[9～11]。

本研究借助大鼠癲癇模型對MRI參數(shù)與腦組織病理特征做對照研究。模型制備方法選擇了海仁酸注射法，該模型相對成熟，具有與人類癲癇相似的行為學(xué)表現(xiàn)，和海馬區(qū)萎縮、硬化等神經(jīng)病理學(xué)改變，且模型對其后癲癇刺激的敏感性長期增強(qiáng)[12～13]。在3個差異參數(shù)中，MK值是DKI技術(shù)的主要參數(shù)，DKI是在DTI的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，是目前唯一能在活體內(nèi)進(jìn)行非侵襲性探測組織微觀結(jié)構(gòu)信息的技術(shù)。研究表明，MK值是水分子沿著空間各方向彌散峰度的平均值，主要用于反應(yīng)局部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度，對腦白質(zhì)微結(jié)構(gòu)變化十分敏感，且不受組織結(jié)構(gòu)空間方位的影響，穩(wěn)定性高[14]。D值與f值是IVIM技術(shù)的主要參數(shù)，其中D值主要反應(yīng)水分子的真實(shí)擴(kuò)散情況，f值主要反應(yīng)微循環(huán)灌注成分所占的比例[15]。目前，IVIM在腫瘤和骨病的診斷中應(yīng)用較多，在腫瘤性疾病中，由于高級別腫瘤增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞密度大，同時新生毛細(xì)血管多，血供豐富，故而可能存在D值降低和f值增大的情況[16]。在某些腫瘤中，雖然新生毛細(xì)血管增多，但同時也面臨著高核漿比和高細(xì)胞密度的情況，微循環(huán)灌注成分所占整體的比例并不一定增多，f值也可能下降[17]。目前，將IVIM用于癲癇診斷的報(bào)道尚不多見，本研究發(fā)現(xiàn)癲癇大鼠的D值和f值都低于對照組，這與其病理改變是密不可分的。反復(fù)癲癇發(fā)作可導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性損傷，產(chǎn)生大量活性的氧自由基[18]，從而導(dǎo)致了局部灌注不足和f值降低。

本研究進(jìn)一步采用擴(kuò)散成像MRI掃描證實(shí)了該模型在腦微結(jié)構(gòu)和功能變化方面具有和原發(fā)性癲癇相似的特征，即海馬、丘腦、顳葉白質(zhì)的MK值、D值及f值與對照組明顯不同，說明該模型用于原發(fā)性癲癇的病理研究基本可靠。并發(fā)現(xiàn)癲癇大鼠海馬區(qū)、丘腦及顳葉白質(zhì)的MK值和病理嚴(yán)重程度、神經(jīng)元凋亡率呈正相關(guān)性，D值及f值與病理嚴(yán)重程度、神經(jīng)元凋亡率呈負(fù)相關(guān)性，進(jìn)一步驗(yàn)證了擴(kuò)散成像MRI評估癲癇病理的可靠性。

綜上所述，本研究通過實(shí)驗(yàn)動物病理對照研究證實(shí)，擴(kuò)散成像MRI能較為準(zhǔn)確的反應(yīng)癲癇患者腦組織病理變化，對其臨床診斷和病情評估可能存在重要價(jià)值。