李曉佳，王勝男，谷 超，孫麗君，趙璐璐，高 原，王琪雯，元曉榮，陳乃宏，李 剛

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特010059；2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所天然活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室）

慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）為腎臟結(jié)構(gòu)或功能異常超過3個月，且對健康產(chǎn)生影響，其診斷標(biāo)準(zhǔn)為腎臟損傷標(biāo)記物的異常，及腎小球濾過率<60mL/min/1.73 m3，任何一項出現(xiàn)超過3個月即可被診斷為慢性腎病[1]。根據(jù)2017年的流行病學(xué)調(diào)查顯示，2017年全球人群中慢性腎病患病率約為9.1%。而我國CKD患者約有1.323億，成為全球慢性腎病患病率最高的國家[2]。慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）是各種慢性腎臟病發(fā)展至后期的共同結(jié)果。高磷血癥是慢性腎衰患者，尤其是終末期腎臟病患者常見的并發(fā)癥。高磷會導(dǎo)致甲狀旁腺功能繼發(fā)性亢進(jìn)、對骨及礦物質(zhì)代謝異常[3]，同時會造成心臟瓣膜、血管以及軟組織等發(fā)生轉(zhuǎn)移性鈣化。

血管鈣化在CKD后期患者中普遍存在，與CKD患者死亡原因密切相關(guān)[4]。血管鈣化（vascular calcification，VC）共有四種類型包括：動脈內(nèi)膜鈣化，動脈中膜鈣化，主動脈瓣鈣化和鈣化防御。在終末期腎病患者中，動脈內(nèi)膜鈣化和中層鈣化比較容易發(fā)生，其中內(nèi)膜鈣化是最常見的類型[5]。目前，關(guān)于高磷誘導(dǎo)血管鈣化的機(jī)制還不是很清楚。研究表明，血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）在血管鈣化過程中起著關(guān)鍵作用，其通過骨/軟骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化的機(jī)制促進(jìn)鈣化的形成[6]。Jakob Voelkl等[7]的研究表明，鋅可通過G蛋白偶聯(lián)受體39（G protein-coupled receptors 39依賴的腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白3（TNFα-inducible protein 3antibody,TNFAIP3）抑制NF-κB信號途徑的激活，進(jìn)而抑制磷酸鹽誘導(dǎo)的VSMCs的成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和減緩血管鈣化的發(fā)展，Jakob Voelkl等的研究還發(fā)現(xiàn)了，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶（SGK1）是血管鈣化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，SGK 1可通過激活NF-κB通路，而促進(jìn)血管鈣化，抑制SGK 1可減輕CKD血管鈣化。綜上所述，NF-κB信號通路在CKD患者血管鈣化的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

目前治療高磷酸血癥的常用藥物主要有：碳酸鈣、碳酸鑭等[8～11]。本文研究一種新型鑭類磷結(jié)合劑－氫氧化鑭，課題組前期研究表明氫氧化鑭可有效降低血清磷水平，保護(hù)腎功能，具有很好的開發(fā)潛力。因此本文中，我們探討了氫氧化鑭對慢性腎衰并發(fā)癥血管鈣化的影響，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了研究，為氫氧化鑭成為臨床候選藥物提供臨床前期的藥理學(xué)研究基礎(chǔ)。

1 實驗動物及試劑

Wistar大鼠，雄性，6周齡，于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司購買（SCXK（京）2016-0006），飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心屏障區(qū)。

氫氧化鑭（實驗室合成）；碳酸鑭（CAS:54451-24-0），碳酸鈣（CAS：471-34-1），腺嘌呤（CAS：73-24-5）購買于Sigma-aldrich；烏拉坦（DC08BA0021，生工生物工程（上海）股份有限公司）；1.2%高磷飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司）；磷測試盒（C006-1-1），鈣測定試劑盒（C004-2-1），肌酐測定試劑盒（C011-2-1），尿素氮測定試劑盒（C013-2-1），均購于南京建成生物工程研究所；大鼠成纖維細(xì)胞生長因子（FGF23）ELSA試劑盒（F4444-B，），大鼠甲狀旁腺（PTH）ELSA試劑盒（F4378-B）購于上海易利生物科技有限公司；核蛋白提取試劑盒（78833，Thermo Scientific NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents）；Anti-Mouse IgG（H+L）,（1:5000,A23910），Anti-Rabbit IgG（H+L）,（1:5000,A23920）購于Abbkine；Transgelin（6G6）抗體（1:600,SC-53932），Runx2抗體（1:600,SC-101145,）購于Santa Cruz Biotechnology；β-Actin抗 體（1:2000,K101527P,Solarbio）；TRAF6抗體（1:5000,ab40675,Abcam）；NF-κB p65抗體（1:500,#6956,Cell Signaling Technology）；Lamin A/C抗體（1;1000,10298-1-AP,Proteintech）；總RNA提取試劑盒（DP419，天根生化科技（北京）有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FSQ-101,ToYoBo Life Science）；熒光定量檢測（SYBR Green）試劑盒（QPK-201，ToYoBo Life Science）。

2 主要儀器

Molecular Devices多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax i3x，美谷分子儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（3-18K，Sigma）；Leica顯微鏡（GmbH,Wetzlar,Germany LEICA DM 2000）；熒光定量PCR儀（PiKoreal96，美國Thermofisher公司）；BIO-RAD基礎(chǔ)電泳儀（1645050，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司）；Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)（Odyssey CLX，美國LICOP公司）。

3 實驗方法

3.1 實驗動物分組及給藥

在1～2周模型大鼠每天按照200 mg/kg的劑量進(jìn)行灌胃，2%腺嘌呤混懸液。3～4周，以相同濃度的腺嘌呤每2天灌一次胃。4周后，大鼠眼眼眶取血離心后取血清進(jìn)行檢測，檢測血清磷、肌酐和尿素氮水平來確定CKD模型是否建造成功。造模成功后隨機(jī)分為氫氧化鑭（LH）組（0.4 g/kg，0.2 g/kg，0.1 g/kg），碳酸鑭（LC）組（0.3 g/kg），碳酸鈣（CC）組（0.42 g/kg）及Model組，每組15只，連續(xù)灌胃給藥8周。另選15只毛色、體態(tài)相近的Wistar大鼠作為Control組，不給予藥物。除對照組外，其他組均給予1.2%高磷飼料，自由飲食，持續(xù)12周。在給藥8周后，測定血清中的磷，肌酐，尿素氮，PTH，F(xiàn)GF23。在給藥結(jié)束后處死所有動物，用20%的烏拉坦麻醉大鼠，腹主動脈采血，離心取血清。將每只動物的胸主動脈一部分于-80℃保存用于Western Blot和qRT-PCR分析，另一部分用10%的中性甲醛固定用于組織病理學(xué)檢查。

3.2 血清生化檢測

使用試劑盒測量血清鈣、磷、肌酐和尿素水平。使用脲酶法評估血清尿素氮水平。肌氨酸氧化酶法用于測量血清肌酐水平，而MTB方法用于評估血清鈣水平。通過大鼠ELISA試劑盒方法測量血清PTH和FGF23水平。

3.3 胸主動脈Von kossa和EVG染色方法

使用4%多聚甲醛將大鼠胸主動脈血管固定好，隨后委托塞維爾生物進(jìn)行Von kossa及EVG染色切片。

3.4 qRT-PCR使用RNA simple Total RNA Kit總RNA

提取試劑盒進(jìn)行胸主動脈總RNA的提取，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Green熒光染料法進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，分析qPCR引物的特異性。對目的基因進(jìn)行分析，GAPDH作為內(nèi)參。引物序列（見表1）。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers

3.5 Western Blot

提取各組大鼠胸主動脈總蛋白及核蛋白，使用BCA法檢測蛋白含量，使用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離，轉(zhuǎn)模，封閉完成后一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗孵育，使用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶成像，實驗獨立重復(fù)4次。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，使用Graphpad Prism 8.0.1及SPSS 2.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖，數(shù)據(jù)處理運用單因素方差分析（One way-ANOVA），P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.01表示差異有顯著性差異。

5 結(jié)果

5.1 氫氧化鑭對CKD大鼠血清生化指標(biāo)的影響

為了評估氫氧化鑭對CKD大鼠血清生化指標(biāo)的影響，我們在造模4周后和給藥8周后分別檢測了CKD大鼠的血清磷、鈣、肌酐、尿素氮水平。造模結(jié)束后，與Control組相比，Model組的血清磷、肌酐、尿素氮均顯著升高，說明已成功建立慢性腎衰高磷血癥大鼠模型。

如圖1所示，給藥8周后，與Model組相比，給予LH各劑量組、LC、CC治療后CKD大鼠血清磷濃度、血清肌酐水平、尿素氮、PTH、FGF-23水平水平均顯著降低，且氫氧化鑭具有劑量依賴性。藥物治療后血清鈣的檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異（見圖1）。

圖1 氫氧化鑭治療慢性腎衰高磷血癥大鼠8周血清檢測結(jié)果Fig.1 Lanthanum Hydroxide Treatment of Chronic Renal Failure Hyperphosphatemia Rats 8 Weeks Serum Test Results.

6.2 氫氧化鑭延緩血管鈣化的發(fā)生及發(fā)展

根據(jù)對FGF23的檢測，我們發(fā)現(xiàn)氫氧化鑭能夠調(diào)節(jié)機(jī)體FGF23水平，降低血管鈣化發(fā)生率。為了進(jìn)一步研究氫氧化鑭對慢性腎衰高磷血癥所致的血管鈣化的影響，我們進(jìn)行了大鼠胸主動脈的病理檢測。

大鼠胸主動脈的Von-kossa及EVG染色結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組大鼠的主動脈血管彎曲膨大、彈性較差、血管中膜可見大量黑色鈣化沉積（見圖2），而且鈣化區(qū)域的彈性纖維減少，并發(fā)生彈性纖維的斷裂（見圖3），而給藥氫氧化鑭后，可看到CKD大鼠血管鈣化沉積明顯減少，并且彈性纖維的斷裂也有所改善。氫氧化鑭（0.4 g/kg）組改善血管鈣化的作用最明顯。實驗中發(fā)現(xiàn)，給藥碳酸鈣后，對血管鈣化的改善程度并不明顯。

圖2 氫氧化鑭治療慢性腎衰高磷血癥大鼠8周后胸主動脈Von kossa染色結(jié)果Fig.2 Von kossa staining results of thoracic aorta in rats with chronic renal failure and hyperphosphatemia after 8 weeks of treatment with lanthanum hydroxide.

6.3 氫氧化鑭對CKD大鼠模型胸主動脈組織Sm22α、Runx2和Traf6 mRNA表達(dá)的影響

為了驗證氫氧化鑭是否通過抑制NF-κB通路抑制血管鈣化的發(fā)生及發(fā)展。我們對CKD大鼠的主動脈血管進(jìn)行了qRT-PCR檢測。

平滑肌22α（Sm22α）是血管平滑肌細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，是收縮型VSMCS標(biāo)記物[12]。Runx2是成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化最關(guān)鍵的特異性轉(zhuǎn)錄因子，它的異常表達(dá)常被作為血管鈣化的早期評價指標(biāo)[13]。我們運用qRT-PCR技術(shù)檢測了主動脈血管的Sm22α、Runx2及NF-κB通路中Traf6的表達(dá)。

如圖4所示，與Control組相比，Model組的血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物Sm22α mRNA的表達(dá)顯著降低（P<0.01），而成骨標(biāo)記物Runx2 mRNA的表達(dá)顯著升高（P<0.01），NF-κB通路中Traf6 mRNA的表達(dá)顯著升高（P<0.01），給予氫氧化鑭治療后，劑量依賴性的逆轉(zhuǎn)了上述基因的表達(dá)（P<0.01）。

圖4 氫氧化鑭對CKD模型大鼠胸主動脈組織Sm22α、Runx2、Traf 6mRNA表達(dá)的影響Fig.4 The effect of lanthanum hydroxide on the expression of Sm22α,Runx2,Traf6 mRNA in the thoracic aorta of CKD model rats.

6.4 氫氧化鑭對CKD大鼠胸主動脈SM22α、RUNX2、TRAF6和NF-κB蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步驗證氫氧化鑭對NF-κB通路的作用，我們運用Western Blot技術(shù)檢測了SM22α、RUNX2及NF-κB通路中TRAF6及NF-κB的蛋白表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)的蛋白以β-actin，為內(nèi)參，細(xì)胞核的蛋白以LaminA為內(nèi)參。如圖5、6所示，與Control組相比，Model組血管平滑肌標(biāo)志性蛋白SM22α表達(dá)顯著降低（P<0.01），而成骨標(biāo)志性蛋白RUNX2表達(dá)顯著升高（P<0.01），表明CKD大鼠血管平滑肌細(xì)胞已經(jīng)由收縮表型向成骨表型轉(zhuǎn)分化。在給藥8周后，與Model組相比，各給藥組SM22α蛋白的表達(dá)升高，RUNX2表達(dá)顯著降低。為了驗證氫氧化鑭是否通過NF-κB通路抑制血管鈣化的發(fā)生，檢測了NFκB及其上游TRAF6的表達(dá)。與Control相比，Model組的TRAF6的表達(dá)顯著增加（P<0.01），胞質(zhì)內(nèi)NFκB的表達(dá)顯著降低（P<0.01，P<0.05），而細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)的表達(dá)顯著升高（P<0.01，P<0.05）。與Model組相比，給予LH各劑量組、LC、CC治療的CKD大鼠TRAF6表達(dá)顯著降低；細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)顯著降低，氫氧化鑭劑量依賴性逆轉(zhuǎn)了上述蛋白的表達(dá)。

圖5 氫氧化鑭對CKD模型大鼠胸主動脈組織細(xì)胞質(zhì)中TRAF6、NF-κB、SM22α蛋白表達(dá)的影響Fig.5 The effect of lanthanum hydroxide on the expression of TRAF6,NF-κB and SM22α in the cytoplasm of the thoracic aorta of CKD model rats.

7 討論

本文研究了一種新型磷結(jié)合劑－氫氧化鑭，通過對血清生化指標(biāo)的檢測和胸主動脈組織病理學(xué)的研究，證明了氫氧化鑭可降低血清磷水平、調(diào)節(jié)鈣磷平衡，延緩CKD血管鈣化的發(fā)生及發(fā)展。并證明了氫氧化鑭可通過抑制NF-κB通路抑制血管鈣化的發(fā)生及發(fā)展。

本文中選用腺嘌呤造模，可在短時間內(nèi)誘發(fā)腎衰竭，動物之間的差異很小，在CKD動物模型后期，可觀察到骨骼異常和血管鈣化，該模型顯示了CKD進(jìn)行性發(fā)作和腎功能衰竭的病程[14～16]。如圖1所示，給藥8周后，與Model組相比，給予LH各劑量組、LC、CC治療后CKD大鼠血清磷濃度、血清肌酐水平、尿素氮水平顯著降低，且氫氧化鑭具有劑量依賴性。由此可知，碳酸鑭和氫氧化鑭（0.2 g/kg）的治療效果相當(dāng)，而氫氧化鑭（0.4 g/kg）的治療效果更好。因此，氫氧化鑭相較于碳酸鑭具有更高的效價。

圖6 氫氧化鑭對CKD模型大鼠胸主動脈組織細(xì)胞核中NF-κB、RUNX2蛋白表達(dá)的影響Fig.6 The effect of lanthanum hydroxide on the expression of NF-κB and RUNX2 protein in the nucleus of the thoracic aorta tissue of CKD model rats.

通過對相關(guān)文獻(xiàn)的查閱以及胸主動脈血管的mRNA和蛋白表達(dá)的檢測，結(jié)果表明：與Control組相比，Model組SM22α的蛋白表達(dá)顯著下降，隨后我們檢測了NF-κB上游的蛋白TRAF6和NF-κB，與Control組相比，Model組的TRAF6的表達(dá)顯著升高，細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB表達(dá)明顯增加，氫氧化鑭給藥8周后，劑量依賴性的逆轉(zhuǎn)了上述蛋白的表達(dá)。綜上所述，氫氧化鑭可通過抑制NF-κB的入核，抑制高磷血癥過程中VSMCs中的成骨轉(zhuǎn)分化，進(jìn)而抑制血管鈣化的發(fā)生及發(fā)展。然而，La3+如何進(jìn)入細(xì)胞，激活NF-κB途徑，抑制血管平滑肌細(xì)胞鈣化，將是我們未來研究的方向。

綜上所述，新型磷結(jié)合劑－氫氧化鑭可有效降低血清磷水平，調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷平衡，具有延緩慢性腎衰血管鈣化發(fā)生和發(fā)展的作用。同時證明了氫氧化鑭是通過阻斷NF-κB通路的激活，抑制慢性腎衰血管鈣化的發(fā)生及發(fā)展。