霍代夏，程丹丹，李瑞娟，劉 佳，顧艷麗，呂曉潔*

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010059）

姜黃素（curcumin，Cur）是姜科植物姜黃中的一種黃色植物多酚，被證實(shí)是姜黃的主要活性成分之一，其藥理作用廣泛，毒性低。臨床前研究表明，有抗炎、抗氧化、抗微生物和抗癌等藥理作用[1~3]。但由于其存在水溶性較差（pH 7.4時(shí)僅為0.0004 mg/mL）、生物利用度低、不易被機(jī)體吸收、快速被清除出體外、光學(xué)不穩(wěn)定、在中性到堿性溶液中極易降解等問題[4]，嚴(yán)重限制了臨床應(yīng)用及相關(guān)制劑的開發(fā)。為了克服這些缺點(diǎn)，研究者嘗試用各種方法來改善姜黃素的溶解和溶出，包括將其制成納米粒、固體分散體[5]、環(huán)糊精包合物、脂質(zhì)體、膠束、微囊、微球等[6]。介孔二氧化硅（mesoporous silica nanoparticals，MSN）是一種孔徑介于2~50 nm的多孔材料，比表面積大，耐熱性、耐pH、耐機(jī)械應(yīng)力和耐水解的能力均較好，且穩(wěn)定、低毒[7]。β-環(huán)糊精（β-Cyclodextrin，β-CD）及其衍生物羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）具有“內(nèi)腔疏水，外部親水”的獨(dú)特性質(zhì)，可以提高藥物的水溶性和穩(wěn)定性[8]。因其無毒、可降解，可直接用于藥物的增溶，通常用于提高口服和腸外給藥藥物的水溶性[9]。

本研究制備了β-CD、HP-β-CD修飾的介孔二氧化硅載體，進(jìn)一步以姜黃素為模型藥制成固體分散體，研究其對(duì)難溶性藥物姜黃素溶解和體外溶出的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Tecnai G2 F20 200kV場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡（美國FEI）、S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立）、DSC 25差示掃描量熱儀（美國TA）、SZ-100-Z2激光粒度測(cè)定儀（日本HORIBA）、TriStar 3020型比表面積及孔徑測(cè)試儀（美國Micromeritics）、TU-1901型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用）、IRAffinity-1傅里葉紅外光譜分析儀（日本島津）、FMC-1000臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器（東京理化）、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南鞏義予華）、ME204/02電子天平（梅特勒-托利多）。

1.2 材料

姜黃素（Cur，HPLC≥98%，四川維克奇）、溴化十六烷基三甲胺（CTAB，≥99%，Biosharp）、硅酸四乙酯（TEOS，99%，安耐吉化學(xué)）、β-環(huán)糊精（β-CD，醫(yī)藥級(jí)，曲阜天利）、2-羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD，97%，羅恩試劑）、十二烷基硫酸鈉（SDS，天津凱通化學(xué)）、其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 MSN、β-CD-MSN、HP-β-CD-MSN的制備

稱量1g CTAB，加入480 mL蒸餾水，充分?jǐn)嚢枋蛊浠旌暇鶆?，加?.5 mL NaOH調(diào)節(jié)pH，加熱使體系穩(wěn)定在80℃，滴加5 mL TEOS，劇烈攪拌下反應(yīng)2 h，之后使體系逐漸降溫。離心，用蒸餾水和無水乙醇充分洗滌沉淀，離心棄上清，沉淀置真空干燥箱干燥過夜。鹽酸：甲醇=50：1（V：V）回流去除模板，無水乙醇洗滌，沉淀真空干燥至恒重，得MSN。

稱量1 g CTAB于480 mL蒸餾水中，反應(yīng)條件同上，在80℃穩(wěn)定片刻后，先加入7.5 g β-CD或1.15 g HP-β-CD攪拌均勻，再滴加5 mL TEOS，反應(yīng)2 h，體系逐漸降溫。用蒸餾水和無水乙醇洗滌沉淀，分離沉淀后置真空干燥箱過夜。鹽酸：甲醇=50：1（V：V）回流去除模板，無水乙醇洗滌，沉淀真空干燥至恒重。分別得到β-CD-MSN、HP-β-CD-MSN。

2.2 載體材料的理化性質(zhì)

2.2.1 電鏡法觀察形態(tài) 將樣品用乙醇分散，滴于銅網(wǎng)，室溫?fù)]干后用透射電鏡觀察不同載體的形貌、粒徑和孔徑。MSN、β-CD-MSN、HP-β-CDMSN形態(tài)均為類圓形，粒徑在80~120 nm之間，可見清晰的中孔結(jié)構(gòu)，修飾了β-CD和HP-β-CD的載體粒徑略增大（見圖1）。

圖1 載體的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscope of carriers

2.2.2 粒徑和zeta電位 粒徑是評(píng)價(jià)納米粒子的一項(xiàng)重要指標(biāo)，其大小和均勻程度影響納米粒子的體內(nèi)分布及代謝。zeta電位影響體系的穩(wěn)定性，電位的絕對(duì)值在30~60 mV之間認(rèn)為體系是穩(wěn)定的。實(shí)驗(yàn)制備的MSN、β-CD-MSN和HP-β-CD-MSN的粒徑均在120~150 nm，因有水化膜存在，測(cè)量得到的粒徑比電鏡觀察到的略大（見表1）。三種樣品在水中zeta電位的絕對(duì)值均在30~40 mV之間，表明本課題制備的載體具有較強(qiáng)的電荷斥力，物理穩(wěn)定性良好。

表1 載體的粒徑和zeta電位值（n=3）Tab.1 Particle size and zeta potential of carriers（n=3）

2.2.3 載體的孔結(jié)構(gòu)參數(shù)N2吸脫附常用來測(cè)定介孔材料的比表面積及孔徑，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的吸附等溫曲線，其形狀與材料孔徑大小、孔類型有關(guān)。為了避免水分對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，測(cè)試前需先對(duì)樣品進(jìn)行真空干燥，之后在120℃下脫氣，除去材料表面及孔道內(nèi)部的水分。

由載體材料的吸附等溫曲線可以看出，三種材料均屬Ⅳ型等溫曲線，表現(xiàn)出了介孔結(jié)構(gòu)的特征（見圖2）。當(dāng)P/P0＜0.2時(shí)，由于在樣品表面發(fā)生了單分子和多分子層吸附，氮?dú)獾奈搅吭黾泳徛?；P/P0介于0.2~0.4時(shí)，低溫下氮?dú)庠跇悠房椎腊l(fā)生了毛細(xì)管凝聚，相對(duì)壓力值迅速增加，圖中有拐點(diǎn)出現(xiàn)，這一現(xiàn)象可證實(shí)了樣品中有介孔結(jié)構(gòu)存在；當(dāng)P/P0介于0.4~0.95時(shí)，相對(duì)壓力比較穩(wěn)定，增大不明顯，說明氮?dú)夥肿游皆跇悠繁砻?；?dāng)P/P0＞0.95時(shí)，由于出現(xiàn)樣品內(nèi)孔道的毛細(xì)管凝集現(xiàn)象，曲線出現(xiàn)了較大變化[10]。另外，由于毛細(xì)管凝聚，可以觀察到，脫吸附等溫線在吸附等溫線上方，呈現(xiàn)出滯后環(huán)。

圖2 載體的氮?dú)馕降葴鼐€（A）和孔徑分布曲線（B）Fig.2 Nitrogen absorption isotherms(A)and pore size distributions(B)of carriers

用BJH（Barret-Joyner-Halenda）和BET（Brunauer-Emmett-Teller）法分析孔結(jié)構(gòu)。幾種介孔二氧化硅載體材料均具有較大的比表面積，加入β-CD后的載體材料與MSN相比，比表面積略有增大，孔容積和孔體積略下降（見表2）。加入HP-β-CD后，比表面積、孔容積和孔徑均較前兩者有一定提高。可見用共縮聚法制備環(huán)糊精修飾的MSN載體，并沒有堵塞介孔孔道，也未改變介孔材料的基本形態(tài)，不同修飾材料對(duì)孔徑影響不同。

表2 載體材料的孔結(jié)構(gòu)參數(shù)Tab.2 Pore structure paramaters of carriers

2.3 Cur含量測(cè)定方法的建立

2.3.1 專屬性考察 精密稱量Cur 2.0 mg，用無水乙醇溶解后，用0.2%SDS稀釋，將MSN、β-CD-MSN和HP-β-CD-MSN用同溶劑稀釋后，在200~700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。Cur溶液在430 nm處有最大紫外吸收，空白載體在此波長(zhǎng)下無吸收，對(duì)藥物測(cè)量無干擾，專屬性良好，故選擇430 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱量Cur 5.0 mg，用無水乙醇溶解后，加0.2% SDS分別配制成濃度為0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mg·L-1的對(duì)照品溶液，430 nm處測(cè)量吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.1901 x+0.0048，R2=0.9995，Cur在0.25~3.00 mg·L-1濃度內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取Cur 3.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解，0.2% SDS定容至刻度，得到對(duì)照品溶液，用0.2% SDS將其稀釋至2.0 mg·L-1，430 nm測(cè)量吸光度，重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算RSD為0.72%，該法的重現(xiàn)性良好。

2.3.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精確配制Cur低、中、高（0.5、1.0、2.0 mg·L-1）不同濃度的對(duì)照品溶液，同1日內(nèi)測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度，RSD值為1.17%。同法每日測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定5日，計(jì)算日間精密度，計(jì)算RSD值為1.82%。表明該法精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 量取2.0 mg·L-1的Cur對(duì)照品溶液，室溫下放置0、2、4、6、8、10 h后測(cè)定吸光度。計(jì)算RSD值為1.67%。說明Cur供試品溶液在室溫條件下，10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 Cur與MSN系列載體固體分散體及物理混合物的制備

分別取50.0 mg MSN、β-CD-MSN、HP-β-CDMSN，室溫狀態(tài)下攪拌并抽真空3 h。另取Cur 10.0 mg，溶于10 mL乙醇中，分別加入上述體系中，攪拌3 h使其充分混合均勻。之后打開瓶塞，加熱攪拌，蒸發(fā)溶劑至干，真空干燥至恒重。收集干燥粉末研勻，得三種載體與Cur的固體分散體，記為Cur-MSN-SD、Cur-β-CD-MSN-SD及Cur-HP-β-CDMSN-SD。

Cur和MSN、β-CD-MSN、HP-β-CD-MSN按照相同比例稱量，置研缽中研勻，過5號(hào)篩，即得Cur和不同載體的物理混合物，記為Cur+MSN、Cur+β-CD-MSN及Cur+HP-β-CD-MSN。

2.5 載藥情況考察

2.5.1 掃描電鏡觀察載藥前后形態(tài) 分別取Cur、空白載體、物理混合物及固體分散體制備樣品，用掃描電鏡觀察其形態(tài)和結(jié)構(gòu)（見圖3）。Cur外形較為粗糙，藥物分子結(jié)晶較大且不均勻（見圖3-A）；三種空白載體的電鏡圖片差別不大，在放大3 k倍的視野下觀察，載體均團(tuán)聚成堆（見圖3-B）；Cur與三種載體的物理混合物電鏡圖片幾乎無差別，在相同的分散條件和放大倍數(shù)下，載體附著在藥物晶體表面，未改變藥物晶體的大小，物理混合物均顯示了藥物和載體的共同特點(diǎn)，二者可清晰區(qū)分（見圖3-C）；三種固體分散體的電鏡圖片顯示，Cur-MSN-SD（圖3-D）和Cur-β-CD-MSN-SD（見圖3-E）呈小塊聚集狀，大小不均，視野中幾乎見不到完整的藥物晶體，無法清晰辨別介孔硅材料和Cur，其微觀形態(tài)與物理混合物不同，分散程度較Cur和物理混合物均有改善。但Cur-HP-β-CD-MSN-SD（見圖3-F）仍然可見藥物晶體。

圖3 樣品的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscope images of samples

2.5.2 差示掃描量熱法（differential scanning calorimeter，DSC）DSC是將樣品和參比物在同等環(huán)境中程序升溫及降溫，通過測(cè)量二者溫差為零時(shí)所須補(bǔ)償?shù)臒崃縼砼袛嗨幬锞w的含量，晶體越多，得到吸熱峰的面積越大。

分別取Cur、空白載體、物理混合物及固體分散體各樣品適量，在掃描溫度50℃~300℃，升溫速度10℃·min-1的條件下進(jìn)行DSC分析。得到原料藥在181℃時(shí)有尖銳的吸熱峰，對(duì)應(yīng)Cur的熔點(diǎn)，物理混合物也在同樣的位置有吸熱峰。Cur-MSN-SD、Cur-β-CD-MSN-SD幾乎沒有峰，而Cur-HP-β-CDMSN-SD在同樣的位置顯示出了吸熱峰（見圖4）。說明模型藥在Cur-HP-β-CD-MSN-SD中只有少部分以無定型的形式存在，而在另外二種材料的固體分散體中藥物的形態(tài)發(fā)生了變化，絕大部分以無定型狀態(tài)存在。

圖4 樣品的DSC曲線Fig.4 Differential Scanning Calorimeter curves of samples

2.5.3 紅外分析 分別取Cur、空白載體、物理混合物及固體分散體適量，與溴化鉀粉末研磨均勻后壓片，測(cè)定其紅外光譜（見圖5）。Cur分子結(jié)構(gòu)中主要有苯環(huán)、-OH、C=O、-OCH3及C=C等。曲線a為Cur的特征吸收峰，3503 cm-1處可歸屬為酚羥基伸縮振動(dòng)，1627 cm-1處為C=O雙鍵的伸縮振動(dòng)，C-O-C的振動(dòng)峰位于1025 cm-1處；b、c、d空白載體表現(xiàn)出了MSN的特征吸收峰，804 cm-1、1095 cm-1處的峰可歸屬為對(duì)稱和不對(duì)稱Si-O-Si伸縮振動(dòng)，468 cm-1和968 cm-1處分別為Si-O-Si彎曲振動(dòng)和Si-OH表面的伸縮振動(dòng)，2856 cm-1處的吸收峰歸屬為CTAB中CH3和CH2的伸縮振動(dòng)。e、f、g分別為空白載體與Cur物理混合物的紅外曲線，仍清晰可見藥物的特征吸收峰。h、i、j分別為三種固體分散體，Cur的特征吸收峰部分被掩蓋，可能由于藥物進(jìn)入載體晶型轉(zhuǎn)變所致，且未發(fā)現(xiàn)新的特征峰，說明Cur與載體材料間僅有物理吸附作用，未產(chǎn)生新的物質(zhì)。

圖5 樣品的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of samples

2.6 藥物溶解度的測(cè)定

稱取過量的Cur、Cur-MSN、Cur-β-CD-MSN和Cur-HP-β-CD-MSN，于0.2% SDS中，室溫下避光，充分振搖至溶解平衡。取溶液過0.22 μm微孔濾膜，用紫外可見分光光度計(jì)在430 nm處測(cè)量吸光度。

通過測(cè)量得到，Cur在0.2% SDS中的溶解度為（22.15±1.30）mg·L-1，Cur-MSN-SD、Cur-β-CDMSN-SD和Cur-HP-β-CD-MSN-SD在相同溶劑中的溶解度分別為（312.78±8.15）mg·L-1、（172.93±3.75）mg·L-1、（27.90±1.81）mg·L-1。Cur-MSN-SD比原料藥的溶解度高了約15倍，Cur-β-CD-MSN比原料藥的溶解度高了8倍多，而Cur-HP-β-CDMSN與原料藥基本持平?？梢姴煌d體材料的固體分散體對(duì)于Cur的增溶效果不同，其中MSN作為載體制備的固體分散體增溶效果最好。

2.7 體外溶出度的測(cè)定

取Cur、Cur-MSN-SD、Cur-β-CD-MSN-SD和Cur-HP-β-CD-MSN-SD適量，使Cur含量保持相同，以0.2% SDS溶液作為溶出介質(zhì)，于（37±0.5）℃，120 rpm振搖。分別于0、5、10、20、30、60、120、240、360 min取樣，取樣后立即補(bǔ)充等體積、同溫的溶出介質(zhì)。采用紫外-可見分光光度法在430 nm處測(cè)定不同時(shí)間下藥物的溶出量。計(jì)算Cur的累積釋放率，并繪制釋放曲線（見圖6）。

圖6 樣品的體外溶出曲線Fig.6 In vitro release curves of samples

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11]，SDS對(duì)降低Cur的水解，保持其穩(wěn)定的作用較強(qiáng)，因此實(shí)驗(yàn)選擇0.2%SDS作為溶出介質(zhì)。從體外釋放結(jié)果可見，Cur在0.2% SDS中幾乎不能溶出，300 min的溶出率在1%以下。在相同的條件下，Cur-MSN、Cur-β-CD-MSN和Cur-HPβ-CD-MSN均有不同程度的溶出，但不同載體增加溶出的效果不同，與Cur相比，Cur-β-CD-MSN-SD的累積溶出效果最好，Cur-MSN-SD次之，Cur-HPβ-CD-MSN剛開始表現(xiàn)出了突釋的現(xiàn)象，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其增加溶出的效果較差。

3 討論

得益于介孔二氧化硅特殊的表面性質(zhì)，將其作為載體與藥物制成固體分散體后，可以抑制藥物晶型轉(zhuǎn)化，并將藥物限制在納米級(jí)尺寸，使藥物保持相對(duì)易溶的無定型或亞穩(wěn)定狀態(tài)。介孔硅表面的硅羥基本身有一定的親水性，能與-OH、-NH2等末端基團(tuán)的分子形成分子內(nèi)氫鍵，改善藥物潤濕性，減小接觸角，增加溶出速率；載體巨大的比表面積增加了藥物與溶出介質(zhì)的接觸，利于載藥體系吸附在胃腸黏膜表面并滯留，促進(jìn)了藥物吸收。有文獻(xiàn)報(bào)道[11]，介孔二氧化硅材料制備的固體分散體可將藥物限制在非晶態(tài)，室溫下保存兩年仍然是穩(wěn)定的。β-CD分子內(nèi)空腔大小適中，應(yīng)用廣泛，對(duì)其2位羥丙基修飾得到HP-β-CD，在不改變其獨(dú)特結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，分子具有更強(qiáng)的不對(duì)稱性，羥丙基的引入可以改變環(huán)糊精的極性和親水性。

根據(jù)不同的介孔硅材料制備的固體分散體增加Cur溶解和體外溶出的效果推測(cè)，由于藥物轉(zhuǎn)變成了無定型狀態(tài)，加之載體巨大的比表面積，使藥物迅速分散于介質(zhì)中，溶劑的浸潤能力增加。但不同載體由于表面性質(zhì)、孔徑孔容大小，對(duì)Cur溶解和體外溶出增加效果不同。Cur-MSN的平衡溶解度最高，但在體外溶出實(shí)驗(yàn)中，β-CD-MSN-SD的釋放最快，累積釋放率也最高。而Cur-HP-β-CD-MSNSD復(fù)合樣品一接觸溶出介質(zhì)即達(dá)到較大的溶出量，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，釋放量下降，對(duì)累積釋放增加的效果不明顯。推測(cè)可能是由以下幾個(gè)原因造成的，首先，HP-β-CD-MSN的孔徑最大，較大的孔隙更容易被加載流體接觸，且容易使藥物重新生成結(jié)晶物質(zhì)。另外，當(dāng)分子被釋放時(shí)，吸附的第一個(gè)單分子層由于作用力更強(qiáng)，更難解吸，會(huì)導(dǎo)致一部分藥物留在載體中[12]。MSN和β-CD-MSN表面性質(zhì)的差異，使其表現(xiàn)出了不同的溶出行為。材料高表面自由能和表面硅烷醇的高反應(yīng)活性也可能導(dǎo)致藥物釋放不完全[13]；修飾基團(tuán)的鍵能差別，也會(huì)造成材料和藥物的穩(wěn)定性不同[14]；調(diào)節(jié)載體的親/疏水性能，藥物的釋放量也會(huì)隨之變化，疏水性材料的藥物釋放更少[15]。

用介孔硅作為固體分散體，可以提高難溶性藥物的溶解和溶出，但MSN與難溶藥物之間的相互關(guān)系并不明確，不同種類的載體如何影響藥物溶解、釋放，如何準(zhǔn)確地選擇載體仍有一定的盲目性，且藥物在體內(nèi)的釋放情況也有待進(jìn)一步確證，但介孔硅在生物相容性及毒副作用方面表現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)和在提高難溶性藥物溶解度方面的潛力值得我們進(jìn)一步探究。