陳國珍，蘇華，張海娟，黨璐，鄭建斌

(1.陜西省石油化工研究設(shè)計院，陜西 西安 710054；2.西北大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710127)

春雷霉素屬于生物農(nóng)藥，作為殺菌劑，具有同時預(yù)防和治療作用，對稻瘟病的防治效果較好。噻霉酮屬于有機雜環(huán)類化合物，以其高效、低毒等特點填補了國際、國內(nèi)在該領(lǐng)域的空白，對真菌細菌類病害有很強的抑殺作用[1-4]。研究表明,二者的復(fù)配劑對番茄斑疹病菌的防治效果優(yōu)于單劑[5]。歐盟規(guī)定春雷霉素最大殘留限量(MRL)為0.01～0.6 mg/kg， 噻霉酮最大殘留限量(MRL)為0.05～1 mg/kg。目前，國內(nèi)外對兩者的檢測方法主要有：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[6]、高效毛細管電泳法[7]、生物測定法[8]、高效液相色譜法(HPLC)等[9-10]。本研究采用HPLC法為春雷霉素和噻霉酮分析制定相關(guān)的國、行標(biāo)奠定了基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)品(85.2%，國家農(nóng)藥檢驗中心 沈陽)；噻霉酮標(biāo)準(zhǔn)品(97.0%，國家農(nóng)藥檢驗中心 沈陽)；乙腈、甲醇均為色譜純；十二烷基硫酸鈉，分析純；7%春雷霉素·噻霉酮可濕性粉劑。

Waters 2695高效液相色譜儀；Millipore超純水機器；梅特勒XP 504分析天平；KQ-250DE超聲波清洗器。

1.2 色譜參數(shù)

色譜柱為150 mm × 4.9 mm(i.d.)不銹鋼柱，內(nèi)裝Eclipse XDB-C18，5 μm填充物；流動相為甲醇-乙腈-水(0.6%十二烷基硫酸鈉，用磷酸調(diào)pH值為2.5)=40∶20∶40(v/v/v)，流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm；進樣體積10 μL；柱溫35 ℃。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取春雷霉素、噻霉酮標(biāo)準(zhǔn)品各0.02 g(精確至0.000 2 g)，于50 mL燒杯中，加入一定量超純水，用超聲波清洗器超聲溶解10 min，至標(biāo)樣溶解完全，冷卻至室溫。轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶，定容，搖勻。采用0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

準(zhǔn)確稱取試樣含春雷霉素和噻霉酮0.02 g(精確至0.000 2 g)，制備方法同標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.3.1 檢驗檢測 在上述1.2節(jié)分離檢測條件下，等基線平穩(wěn)后，連續(xù)進數(shù)針標(biāo)準(zhǔn)品溶液，直至相鄰兩針標(biāo)準(zhǔn)品之間的響應(yīng)值相對誤差小于1.5%時，按照標(biāo)品、樣品、標(biāo)品、樣品、標(biāo)品的順序進行進樣檢測。

春雷霉素和噻霉酮標(biāo)準(zhǔn)樣品的高效液相色譜見圖1(A)，春雷霉素和噻霉酮樣品高效液相色譜見圖1(B)。

圖1 春雷霉素和噻霉酮標(biāo)品

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

研究采用不銹鋼柱150 mm × 4.9 mm(i.d.)，所用色譜柱為Eclipse XDB-C18。采用不同比例甲醇-乙腈-水(0.6%十二烷基硫酸鈉，用磷酸調(diào)pH值為2.5)作為流動相。通過大量的實驗數(shù)據(jù)，綜合分離度、峰形以及保留時間等因素，流動相的最優(yōu)化體積比為甲醇-乙腈-水(0.6%十二烷基硫酸鈉，用磷酸調(diào)pH值為2.5)=40∶20∶40(v/v/v)，流速為1.0 mL/min，春雷霉素和噻霉酮分離效果較好，且保留時間合適。

2.2 線性關(guān)系

在上述實驗條件下，配制一系列含有不同質(zhì)量濃度春雷霉素(噻霉酮)標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行實驗。分別以春雷霉素和噻霉酮標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度C(g/L)為橫坐標(biāo)，以春雷霉素和噻霉酮的峰面積A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。

圖2 春雷霉素(A)和噻霉酮(B)的線性關(guān)系Fig.2 Linear correlation of kasugamycin and benziothiazolinone

由圖2可知，春雷霉素的線性方程為y=4 248.2+4.0x，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 7；噻霉酮的線性方程為y=88 817.3+1.2×107x，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 6。實驗結(jié)果表明，春雷霉素、噻霉酮的質(zhì)量濃度與峰面積之間具有良好的線性關(guān)系。

2.3 方法精密度的測定

對同一批次7%春雷霉素·噻霉酮可濕性粉劑，在1.2節(jié)色譜條件下，平行測定5次，結(jié)果見表1。

表1 春雷霉素和噻霉酮的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Relative standard deviation(RSD) of kasugamycin and benziothiazolinone

由表1可知，春雷霉素和噻霉酮的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.8%和2.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.396%和0.548%，結(jié)果表明所建立方法具有良好的精密度，可以用于實際樣品的檢驗檢測。

2.4 加標(biāo)回收率

在7%春雷霉素·噻霉酮可濕性試樣中分別加入一定量的春雷霉素和噻霉酮標(biāo)準(zhǔn)樣品，在1.2節(jié)色譜條件下，測定春雷霉素和噻霉酮含量，加標(biāo)回收率結(jié)果見表2。

表2 春雷霉素和噻霉酮加標(biāo)回收率Table 2 Recovery test results of kasugamycin and benziothiazolinone

由表2可知，春雷霉素加標(biāo)回收率在98.0%～101.8%之間，平均回收率為99.6%；噻霉酮加標(biāo)回收率在98.9%～102.6%之間，平均回收率為101.2%?？芍摲椒梢詼?zhǔn)確分析制劑中春雷霉素(噻霉酮)的含量。

3 結(jié)論

建立了利用高效液相色譜法同時快速檢測春雷霉素、噻霉酮含量的方法。該方法具有分離效果好，線性關(guān)系良好，操作簡單等優(yōu)點。能夠適用于質(zhì)檢機構(gòu)與生產(chǎn)企業(yè)對春雷霉素和噻霉酮的質(zhì)量監(jiān)督與控制，為春雷霉素和噻霉酮分析制定相關(guān)的國、行標(biāo)奠定了基礎(chǔ)。