陳觀蘭,陳菁,陳建平,李瑞,賈學(xué)靜,劉曉菲,宋兵兵,鐘賽意,2*

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室,廣東省海洋食品 工程技術(shù)研究中心,廣東 湛江,524008) 2(大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,遼寧 大連,116034)

肝素屬于糖胺聚糖家族,是一種硫酸多糖。各種分子質(zhì)量肝素作為主要的抗凝藥物應(yīng)用于抗血栓基本的治療。目前的肝素主要來源于豬、牛等陸地動(dòng)物,但存在瘋牛病事件、雜質(zhì)污染事件及宗教信仰等問題，以及出血、骨質(zhì)疏松癥、血小板減少癥等副作用，因此尋找陸地動(dòng)物源肝素替代物質(zhì)變得迫切[1]。與傳統(tǒng)肝素相比,海洋生物硫酸多糖來源相對(duì)清潔,而且具有作用途徑多樣、副作用較小的抗血栓活性,是替代傳統(tǒng)肝素的潛力來源[2-5]。

海蚌學(xué)名“西施舌”(Coelomactraantiquata),隸屬于軟體動(dòng)物門的瓣鰓綱,真瓣鰓目,蛤蜊科,腔蛤蜊屬,在我國山東至廣東沿海等地均有分布。海蚌不僅具有較高的營養(yǎng)價(jià)值,也具有一定的保健價(jià)值。研究表明,海蚌具有抗氧化、降血脂[6]、降血糖[7]、抗腫瘤[8-9]、溶菌[10]活性。此外,本課題組前期通過酶解提取,大孔陰離子交換樹脂純化得到了一種具有高硫酸基含量、良好纖溶活性、強(qiáng)抗凝活性的大分子質(zhì)量肝素G2[11]。但大分子質(zhì)量肝素具有黏度大、溶解性差,生物利用度低等缺點(diǎn)[12],且肝素的抗血栓活性與分子質(zhì)量有關(guān),低分子質(zhì)量肝素相比普通分子質(zhì)量肝素,其抗血栓活性具有作用多途徑、多靶點(diǎn)、副作用少等特點(diǎn)[2]。因此,本文對(duì)海蚌肝素G2及其降解產(chǎn)物DG1、DG2進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,并研究其抗凝血、纖溶活性,以期為拓寬肝素的海洋生物來源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海蚌,廣東省湛江市水產(chǎn)品批發(fā)市場；2709堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、PBS磷酸鹽粉劑、瓊脂糖、綿羊血漿,上海源葉生物科技有限公司；Amberlite FPA98Cl型離子交換樹脂、Na2SO4,上海麥克林生化科技有限公司；肝素(Mw：3.5 k、5 k、8 k、15 k、30 kDa),北京阿斯雷爾生物技術(shù)有限公司；肝素標(biāo)準(zhǔn)品(heparin,HP,190 IU/mg)、低分子質(zhì)量肝素標(biāo)準(zhǔn)品(low molecular weight heparin,LMWH),抗Ⅱa、Ⅹa因子效價(jià)分別為571 IU/安瓿、1 497 IU/安瓿、凝血酶(1 000 U)、尿激酶(50 U/mg)、牛纖維蛋白原,中國食品藥品檢定研究所；部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time,PT)和血漿凝血酶時(shí)間(thrombin time,TT)試劑盒,武漢中太生物技術(shù)有限公司；甲醇(色譜純),賽默飛世爾科技公司；無水乙醇、NaCl等其他試劑,西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州國華電器有限公司；Sorvall Lynx6000高速落地離心機(jī),賽默飛世爾科技公司；N-4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,東京理化器械株式會(huì)社；FD8508型真空冷凍干燥機(jī),韓國ilShin公司；Agilent1200高效液相色譜儀,美國安捷倫公司；Bruker Tensor-27傅里葉紅外光譜儀、Bruker Dimension Edge原子力顯微鏡,德國Bruker公司；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀器；Chirascan圓二色光譜儀,英國應(yīng)用光物理公司；JEM-7610-F掃描電子顯微鏡,日本JEOL公司；XN06半自動(dòng)凝血分析儀,武漢景川診斷技術(shù)股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 不同分子質(zhì)量海蚌肝素的制備

參考文獻(xiàn)[11]并略作修改，將海蚌去殼，勻漿。料液比1∶10(g∶mL)，6 mg/mL的NaCl溶液，5.4 mg/mL的木瓜蛋白酶和5.4 mg/mL的2709堿性蛋白酶(pH 8.0，50 ℃)，酶解20 h，沸水浴滅酶10 min，冷卻后離心(8 000 r/min，30 min)，取上清液濃縮得海蚌肝素酶解液；以FPA98 CI大孔離子交換樹脂層析柱(26 cm×100 cm)對(duì)海蚌肝素進(jìn)行分離純化，動(dòng)態(tài)吸附上樣后，用0、0.5、1、1.5 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集1.5 mol/L的NaCl溶液的洗脫液，每管均收集10 mL，以阿利新藍(lán)比色法檢測肝素含量，以收集管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值(A490 nm)為縱坐標(biāo)繪洗脫曲線。根據(jù)峰型收集洗脫液，濃縮后加入0.4倍體積的無水乙醇醇沉，透析(3 kDa)、凍干后得海蚌肝素G2。

采用H2O2-維生素C降解法降解G2獲得DG1、DG2。DG1降解劑為4 mmol/L H2O2和5 mmol/L 維生素C,DG2降解劑為64 mmol/L H2O2和5 mmol/L 維生素C,樣品濃度均為5 mg/mL。

1.3.2 不同分子質(zhì)量海蚌肝素的分子質(zhì)量測定

通過高效凝膠色譜法測定樣品分子質(zhì)量。用流動(dòng)相把海蚌肝素樣品和肝素分子質(zhì)量窄標(biāo)(平均分子質(zhì)量分別為3.55 k、5.2 k、7.4 k、15 k、30 kDa)配制成為5 mg/mL的溶液,用0.22 μm的濾膜過濾后待用。采用Waters Ultra hydrogel TM500色譜柱(10 μm,7.8 mm×300 mm),在流動(dòng)相為0.2 mol/L Na2SO4溶液,流速0.5 mL/min,柱溫35 ℃,進(jìn)樣量10 μL的條件下以1200示差折光檢測器檢測肝素分子質(zhì)量窄標(biāo)和海蚌肝素樣品的高效凝膠色譜法圖,記錄保留時(shí)間后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3.3 不同分子質(zhì)量海蚌肝素的結(jié)構(gòu)分析

1.3.3.1 傅里葉紅外光譜分析

將海蚌肝素樣品與KBr(質(zhì)量比1∶100)混勻,研磨后壓制成半透明薄片,采用傅里葉紅外光譜在4 000～400 cm-1處進(jìn)行掃描。

1.3.3.2 圓二色譜分析

將海蚌肝素樣品配制成0.5 mg/mL的溶液。在25 ℃條件下,以圓二色譜儀在190～240 nm波長范圍進(jìn)行掃描。

1.3.3.3 掃描電鏡分析

將適量海蚌肝素樣品置于銅片上,粘貼固定,鍍金,在30 kV條件下對(duì)海蚌肝素的表面形態(tài)進(jìn)行觀察并拍照。

1.3.3.4 原子力顯微鏡分析

海蚌肝素樣品溶液(10 μg/mL)以0.45 μm一次性濾器過濾,取5～10 μL滴在云母片表面上,室溫下干燥過夜后以原子力顯微鏡觀測其微觀形貌。

1.3.4 不同分子質(zhì)量海蚌肝素的抗凝血與纖溶活性分析

1.3.4.1 抗凝效價(jià)測定

按照中國藥典中肝素鈉效價(jià)的測定方法進(jìn)行測定[13]。

1.3.4.2 體外抗凝血活性評(píng)價(jià)

采用APTT、PT、TT試劑盒分析海蚌肝素樣品的體外抗凝血活性。所用血漿購自試劑公司的新鮮羊血漿。陰性對(duì)照為生理鹽水,陽性對(duì)照為肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.4.3 纖溶活性評(píng)價(jià)

海蚌肝素的體外纖維蛋白溶解活性通過瓊脂糖-纖維蛋白平板法測定[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子質(zhì)量海蚌肝素分子質(zhì)量測定結(jié)果

采用H2O2-維生素C降解法制備不同分子質(zhì)量海蚌肝素。H2O2作為強(qiáng)氧化劑,可以產(chǎn)生大量的強(qiáng)氧化性的自由基,它可以破壞糖苷鍵,降解多糖[14]。由圖1可知,隨著H2O2濃度增大,降解產(chǎn)物分子質(zhì)量先急速下降后緩慢下降。當(dāng)H2O2濃度達(dá)到16 mmol/L時(shí),H2O2濃度的增加對(duì)降解產(chǎn)物的分子質(zhì)量影響不明顯。這是因?yàn)檫^量的H2O2可能會(huì)被各種機(jī)制消耗并破壞剛剛形成的OH·[15]。因此,為了得到不同分子質(zhì)量的海蚌肝素,本實(shí)驗(yàn)以G2為原料,通過控制H2O2濃度獲得DG1、DG2。通過高效凝膠色譜對(duì)G2、DG1、DG2的分子質(zhì)量進(jìn)行分析。結(jié)果如圖2所示,G2、DG1、DG2的色譜峰單一,且峰形隨著分子質(zhì)量的降低變得狹窄,說明不同分子質(zhì)量海蚌肝素純度均較高,降解使海蚌肝素質(zhì)量分布更為均一。肝素標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(y)與保留時(shí)間(x)的線性方程為：y=-0.306 6x+9.970 1(R2=0.997 6),以此計(jì)算出G2、DG1、DG2的分子質(zhì)量分別為60.25 k、24.48 k、6.75 kDa。

圖1 H2O2濃度對(duì)降解產(chǎn)物分子質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of H2O2concentration on molecular weight of degraded products

圖2 不同分子質(zhì)量海蚌肝素的高效凝膠色譜圖Fig.2 HPGPC chromatogram of clam heparin with different molecular weights

2.2 不同分子質(zhì)量海蚌肝素的結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 紅外色譜分析

對(duì)G2、DG1、DG2進(jìn)行紅外光譜掃描,結(jié)果如圖3所示,890、940 cm-1左右出現(xiàn)了肝素的特征峰,1 240 cm-1左右呈現(xiàn)O—S鍵伸縮振動(dòng)峰,800～850 cm-1處呈現(xiàn)了氨基己糖上硫酸基團(tuán)的C—O—S系統(tǒng)伸縮振動(dòng)峰[1,16]。G2、DG1、DG2的紅外色譜圖基本相似,特征吸收峰和重要官能團(tuán)種類未發(fā)生變化,但隨著分子質(zhì)量的降低,光譜峰峰值增加,說明G2、DG1、DG2在官能團(tuán)上無明顯差異,符合肝素的紅外色譜特征,且H2O2-維生素C降解法降解海蚌肝素的過程對(duì)基本結(jié)構(gòu)和活性基團(tuán)沒有影響,可能只是糖苷鍵斷裂,暴露取代基,降低分子質(zhì)量的過程,而使相應(yīng)紅外吸收信號(hào)增強(qiáng)[17-19]。

圖3 不同分子質(zhì)量海蚌肝素的紅外光譜圖Fig.3 Fourier transform infrared spectrogram of clam heparin with different molecular weights

2.2.2 圓二色譜分析

圓二色譜是研究化合物三維結(jié)構(gòu)的有效方法。G2、DG1、DG2及HP、LMWH在190～260 nm處的圓二色譜如圖4所示。它們峰值均出現(xiàn)在210 nm左右,但峰值不同。商品肝素與海蚌肝素的色譜峰均隨著分子質(zhì)量的降低,峰值變小。這些結(jié)果表明,降解可能在一定程度上影響肝素的結(jié)構(gòu)[20]。

a-HP和LMWH；b-不同分子質(zhì)量海蚌肝素圖4 HP、LMWH及不同分子質(zhì)量海蚌肝素的圓二色譜圖Fig.4 CD chromatogram of HP,LMWH and clam heparin with different molecular weights

2.2.3 掃描電鏡分析

對(duì)3種分子質(zhì)量的海蚌肝素分別進(jìn)行掃描電鏡觀察,結(jié)果如圖5所示。在1 000、3 000、10 000倍鏡下進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)海蚌肝素G2呈表面粗糙、多孔的片狀結(jié)構(gòu)。而DG1、DG2在1 000倍下進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)隨著分子質(zhì)量的降低,碎片狀結(jié)構(gòu)和球狀結(jié)構(gòu)增加。這可能與降解后分子質(zhì)量降低[21-22]或海蚌肝素的分子極性變化有關(guān)[23]。

a-G2(×1 000)；b-G2(×3 000)；c-G2(×10 000)； e-DG1(×1 000)；f-DG2(×1 000)圖5 不同分子質(zhì)量海蚌肝素的掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron microscope graphs of clam heparin with different molecular weights

2.2.4 原子力顯微鏡分析

圖6顯示了在原子力顯微鏡下不同分子質(zhì)量海蚌肝素的分子形態(tài)。在平面圖像中G2呈現(xiàn)網(wǎng)鏈狀結(jié)構(gòu),每個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈情況均清晰可見；DG1呈分散的鏈狀結(jié)構(gòu)；DG2呈現(xiàn)顆粒狀結(jié)構(gòu),降解前后海蚌肝素的分子形態(tài)有很明顯的變化。原子力顯微鏡分析結(jié)果和掃描電鏡分析結(jié)果是一致的。

a-G2；b-DG1；c-DG2圖6 不同分子質(zhì)量海蚌肝素的原子力顯微鏡圖Fig.6 Atomic force microscope graphs of clam heparin with different molecular weights

2.3 不同分子質(zhì)量海蚌肝素的抗凝血與纖溶活性分析

2.3.1 抗凝效價(jià)測定結(jié)果

肝素的抗凝血活性與它的分子質(zhì)量和活性五糖序列有關(guān)。HP、LMWH均具有活性五糖序列,HP可抑制凝血因子Xa、Ⅱa活性而起抗凝活性,而LMWH僅能作用于Xa。肝素分子質(zhì)量越大,抗Ⅱa效價(jià)越高,而抗Xa效價(jià)越低。此外,當(dāng)肝素的活性五糖序列受到破壞,其抗凝活性將明顯降低[2]。有研究表明肝素抗Xa/IIa值越大,其抗血栓活性越強(qiáng)[1]。因此,抗Xa效價(jià)、抗IIa效價(jià)和它們的比值常用來比較不同分子質(zhì)量肝素的抗凝活性。不同分子質(zhì)量海蚌肝素抗凝血效價(jià)如表1所示,海蚌肝素的抗IIa效價(jià)隨著分子質(zhì)量的降低而降低,而抗Xa效價(jià)隨著分子質(zhì)量的降低先上升后降低,DG1抗Xa效價(jià)比G2高,DG2比DG1、G2都低。于DG2而言,分子質(zhì)量的降低并沒有提高它的抗Xa效價(jià),這可能是因?yàn)榻到獬潭冗^大破壞了肝素的活性五糖結(jié)構(gòu)域。此外,在抗Xa/IIa比值上,DG2

表1 不同分子質(zhì)量海蚌肝素抗凝血效價(jià)分析Table 1 Anticoagulant titer analysis of mussel heparin with different molecular weights

2.3.2 抗凝血活性

研究者們經(jīng)常通過測定APTT、PT、TT來研究樣品的抗凝活性及其作用途徑。APTT、PT、TT分別反映內(nèi)源凝血途徑、外源凝血途徑和共同凝血途徑的凝血情況。由圖7可知,在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)G2和DG1的APTT、TT、PT均與生理鹽水有顯著差異,具有劑量依賴效應(yīng),且相近；而DG2的APTT、TT、PT相對(duì)于G2、DG1明顯降低,且在低濃度時(shí)與生理鹽水無顯著差異；與肝素標(biāo)準(zhǔn)品相比,即使質(zhì)量濃度達(dá)到10 μg/mL時(shí),G2、DG1、DG2抗凝活性依舊明顯弱于肝素。

通過結(jié)果來看,推斷G2與DG1的抗凝血活性接近且均能通過內(nèi)源、外源和共同凝血途徑發(fā)揮抗凝血活性,而DG2的抗凝活性與G2相比較低。這可能是因?yàn)镈G1的分子質(zhì)量接近于普通分子質(zhì)量肝素,DG2的分子質(zhì)量接近于低分子質(zhì)量肝素。此外不同分子質(zhì)量的海蚌肝素的抗凝血活性都較為緩和,可能具有較低的出血副作用。

a-PT；b-TT；c-APTT圖7 不同分子質(zhì)量海蚌肝素的抗凝血活性Fig.7 Anticoagulant activity of mussel heparin with different molecular weights 注：與生理鹽水相比,*表示差異顯著,P<0.05；**表示差異極顯著,P<0.01

2.3.3 纖溶活性

采用瓊脂糖凝膠纖溶平板法評(píng)價(jià)不同分子質(zhì)量海蚌肝素的纖溶活性。不同濃度尿激酶產(chǎn)生的溶圈大小(x)與纖溶活性(y)的指數(shù)方程為y=0.058 5e1.243 6x,R2=0.994 3,相關(guān)性良好。測得不同分子質(zhì)量海蚌肝素與商品肝素的纖溶活性如表2所示。海蚌肝素和商品肝素的纖溶活性均隨著分子質(zhì)量的降低而增大。測得海蚌肝素中DG2纖溶活性最強(qiáng),DG1次之,G2最??；商品肝素LMWH的纖溶活性遠(yuǎn)高于HP,約為HP的6倍。DG2的纖溶活性約為HP的77%,而遠(yuǎn)低于LMWH,僅為LMWH的13%。

表2 不同分子質(zhì)量海蚌肝素纖溶活性分析Table 2 Analysis of fibrinolytic activity of mussel heparin with different molecular weights

3 結(jié)論與討論

冠心病、腦卒中等血栓性疾病已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[24]。正常生理狀態(tài)下,血液處于凝結(jié)與纖溶的動(dòng)態(tài)平衡中,而當(dāng)疾病、藥物和不合理膳食等危險(xiǎn)因素出現(xiàn)而使內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí),血液成分和血液流變學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化,血液傾向于凝結(jié)而形成血栓。故抗血栓活性的研究常從纖溶與抗凝血活性的角度進(jìn)行。肝素的抗血栓活性與分子質(zhì)量有關(guān)，不同分子質(zhì)量的肝素的抗血栓活性具有不同的作用途徑及特點(diǎn),可應(yīng)用于不同血栓性疾病的治療。此外,肝素是一種多糖,活性也受結(jié)構(gòu)的影響[25]。

本文對(duì)不同分子質(zhì)量海蚌肝素G2、DG1、DG2的結(jié)構(gòu)特性和抗凝血、纖溶活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明海蚌肝素G2、DG1、DG2的重均分子質(zhì)量分別為60.25 kDa(大分子質(zhì)量)、24.48 kDa(普通分子質(zhì)量)、6.75 kDa(低分子質(zhì)量)；紅外色譜顯示,降解前后海蚌肝素的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)變化不明顯,但隨著分子質(zhì)量的降低,官能團(tuán)或特征峰峰值增加,降解并沒有破壞海蚌肝素的基本結(jié)構(gòu)和活性基團(tuán)；降解前后海蚌肝素的高級(jí)結(jié)構(gòu)變化明顯,隨著分子質(zhì)量降低,海蚌肝素的圓二色譜峰峰值變小,掃描電鏡圖譜顯示海蚌肝素的碎片狀結(jié)構(gòu)及球狀結(jié)構(gòu)增加,原子力顯微鏡圖顯示海蚌肝素的網(wǎng)線狀結(jié)構(gòu)先被降解成鏈狀結(jié)構(gòu),后聚集成顆粒結(jié)構(gòu)；DG1的抗Xa/IIa比值最大,為2.13；通過測定APTT、TT、PT值,發(fā)現(xiàn)DG2與G2的抗凝血活性接近,但DG2的抗凝活性顯著降低,這可能與不同海蚌肝素的分子質(zhì)量有關(guān),此外G2、DG1、DG2的抗凝活性明顯弱于肝素,提示不同分子質(zhì)量海蚌肝素可能具有較低的出血副作用；隨著分子質(zhì)量的降低,纖溶活性升高,DG2的纖溶活性約為HP的77%,LMWH的13%。綜上所述,不同分子質(zhì)量的海蚌肝素的基本結(jié)構(gòu)和活性基團(tuán)一致,但具有不同的高級(jí)結(jié)構(gòu)特征,緩和的抗凝血活性和良好的纖溶活性,可能具有較低的出血副作用和作用途徑不同的更強(qiáng)的抗血栓活性,有利于開發(fā)更為安全的抗血栓活性物質(zhì)。今后將進(jìn)一步分析不同分子質(zhì)量海蚌肝素的體外抗血小板聚集和體內(nèi)抗血栓活性,為尋找更加安全、有效的抗血栓藥物提供一定的理論依據(jù)。