張超越,張雪穎,胡錦華*,周鵬

1(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122) 3(江南大學 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 無錫,214122) 4(松下電器研究開發(fā)(蘇州)有限公司,江蘇 蘇州,215123)

人乳是一切嬰幼兒配方食品的黃金標準,人乳中豐富的營養(yǎng)成分還會隨著嬰兒的需求有特異性的轉變,具有動物奶或嬰幼兒配方奶粉無可比擬的優(yōu)勢[1-2],因而研究人乳成分及其影響因素對未來開發(fā)高品質(zhì)的嬰幼兒配方食品具有重要意義?，F(xiàn)代女性需要面對來自工作、家庭、學業(yè)等多方面的壓力,因此越來越多的媽媽選擇將人乳泵出經(jīng)低溫儲存后再喂哺嬰兒。儲存位置一般選擇家用冰箱的4 ℃冷藏區(qū)和-18 ℃凍藏區(qū)?，F(xiàn)有的研究主要基于人乳微生物、宏量營養(yǎng)素[3]及免疫活性物質(zhì)[4]等方面的數(shù)據(jù)給出人乳保存建議[5],但是關于低溫保存下人乳風味的研究還比較有限。實際生活中,媽媽們的喂哺實踐經(jīng)驗表明嬰兒對凍藏后人乳風味的接受程度存在個體差異[6],這表明低溫儲存條件的差異性不僅會對人乳的微生物、宏量營養(yǎng)素及免疫活性物質(zhì)產(chǎn)生影響,還會使人乳的風味發(fā)生變化,進而可能影響嬰兒對人乳的接受程度。

人乳風味是由不同類別的物質(zhì)組成,包括醛類、醇類、酯類、脂肪酸氧化產(chǎn)物、酮類、內(nèi)酯類和烴類等[7]。嬰兒可以通過接觸人乳中的味道來學習未知味道,從而促進嬰兒接受新的口味[8],并影響其今后對食物的選擇[9-10]。BUETTNER[11]研究組通過感官及二維高分辨氣相色譜-質(zhì)譜/嗅覺法定量研究了4 和-19 ℃下人乳香氣的變化,-19 ℃凍藏人乳隨著儲存時間的延長,其特征香氣和選定標記物會產(chǎn)生劇烈的變化,而4 ℃冷藏人乳則沒有產(chǎn)生同樣程度的變化。另外,在-19 ℃凍藏人乳中因脂質(zhì)氧化而產(chǎn)生的不良氣味急劇增加,而這一現(xiàn)象在4 ℃冷藏下沒有觀察到。這可能是由于凍藏導致乳脂結晶,破壞人乳脂肪球(human milk fat globule,HMFG)膜,導致乳脂分解[12-13],從而產(chǎn)生典型的酸敗氣味。因此推測HMFG膜結構的完整性可能影響人乳的風味。HMFG的相關研究還表明HMFG的粒徑、HMFG膜的微觀結構等會影響脂解程度,對嬰兒的脂質(zhì)消化與吸收產(chǎn)生顯著影響[14-15]。因此研究不同儲存條件下HMFG的微觀結構變化及其對人乳風味的影響就顯得尤為重要。

本研究以新鮮人乳為原料,在4、-18 ℃下分別儲存2、4和7 d,主要研究低溫儲存對HMFG微觀結構的影響,并在此基礎上考察HMFG膜結構的完整性對人乳揮發(fā)性風味化合物和味覺信號的影響,以期為低溫儲存人乳和未來高品質(zhì)嬰幼兒配方奶粉的研究提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人乳,無錫愛爾貝月子會所；NaCl、三氯甲烷、NaOH、丙酮、無水乙醚、石油醚(沸程30～60 ℃)及無水乙醇,國藥集團化學試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉,生工生物工程(上海)股份有限公司；2-甲基-3-庚酮,梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片,美國Petrifilm公司；非酯化游離脂肪酸(non-esterified free fatty acid,NEFA)試劑盒,南京建成生物工程研究所。實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LRH-250CA低溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學儀器有限公司；W621CG冰箱,日本Panasonic公司；SCIONSQ-456-GC氣質(zhì)聯(lián)用儀,美國布魯克公司；SA402B味覺分析系統(tǒng),日本INSENT公司；Seven Compact S220酸度計,瑞士METTLER公司；S3500激光粒度分析儀,美國Microtrac公司；TCS SP8共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy,CLSM),德國Leica公司；BHC-1300Ⅱ A/B2生物潔凈安全柜,浙江蘇凈凈化設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 人乳采集及分裝

采集對象為無錫愛爾貝月子會所的15位哺乳期為1～6月齡的志愿者媽媽。收集7∶00～8∶00通過泵奶器泵出的人乳,2 h內(nèi)帶回實驗室；將所有的人乳混合在一起,按照每個指標所需要的人乳量進行分裝,并立即放入特定的溫度下進行儲存。檢測新鮮人乳樣品的菌落總數(shù)為(2.92±0.22)×104CFU/mL,蛋白含量為(11.65±0.59) mg/mL,脂肪含量為(3.77±0.10) g/dL,乳糖含量為(7.98±0.12) g/dL。

1.3.2 人乳菌落總數(shù)檢測

移取1 mL經(jīng)40 ℃復溫的人乳置于裝有9 mL 0.85%的NaCl溶液的玻璃試管中(即稀釋10倍),記為10-1,重復上述操作將人乳樣品進行梯度稀釋,分別稀釋至102、103及104倍,分別記為10-2、10-3、10-4；吸取1 mL稀釋液垂直滴加在菌落測試片中央位置,用專業(yè)壓板輕輕按壓使得樣液均勻分散形成圓形培養(yǎng)面積,拿起壓板,待菌落測試上的樣液凝固后,將菌落測試片置于32 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(48±3) h。以上所有操作均在超凈臺內(nèi)完成,實驗中所用到的試劑及槍頭等均經(jīng)立式自動壓力蒸汽滅菌器滅菌。菌落總數(shù)計算如公式(1)所示[16-17]：

(1)

式中：N,樣品總菌落數(shù)；ΣC,平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和；n1,第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個數(shù)；n2,第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個數(shù)；d,稀釋因子(第一稀釋度)。

1.3.3 人乳中脂肪含量、NEFA含量及pH值的測定

參考Rose-Gottlieb法測定脂肪含量[18]；南京建成試劑盒檢測樣品NEFA含量；酸度計檢測人乳樣品pH值。

1.3.4 HMFG粒徑及CLSM觀察

1.3.4.1 HMFG粒徑檢測

采用激光粒度分析儀進行HMFG粒徑檢測。其中,粒度的測定選擇濕法檢測,設置樣品為非球形、折射率1.46進行測定。吸取0.5 mL樣品于2 mL離心管中,為裂解乳中的酪蛋白膠束,避免HMFG的聚集,依次加入0.5 mL 35 mmol/L的EDTA/NaOH(pH 7.0)和0.5 mL 1%的SDS溶液,混勻后移取適量樣品于粒度儀樣品池中,使得紅色條帶恰好落于綠色區(qū)域內(nèi)符合加樣量的要求后開始檢測[19]。

1.3.4.2 HMFG-CLSM觀察

吸取200 μL人乳樣品于1 mL離心管中,加入2 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的尼羅紅染料對其中的甘油三酯染色標記。混合均勻后,將其置于室溫下避光反應20 min,移取8 μL樣品于載玻片上,加蓋玻片后固封4周,然后倒置在CLSM載物臺上,采用Ar+激光器在488 nm下激發(fā)尼羅紅探針,于×40倍物鏡下觀察乳樣的微觀結構[19]。

1.3.5 人乳風味檢測

采用GC-MS檢測分析人乳揮發(fā)性風味物質(zhì)。取5 mL人乳置于20 mL頂空進樣瓶中,然后加入10 μL質(zhì)量濃度為10 mg/L的內(nèi)標物溶液(2-甲基-3-庚酮)；將固相微萃取針插入頂空瓶中的人乳上方進行頂空吸附(60 ℃恒溫水浴吸附30 min)；吸附結束后立即將萃取針插入GC-MS的進樣口內(nèi),解吸8 min[20-21]。采用日本INSENT公司的SA402B電子舌檢測人乳滋味變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20軟件對實驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析,不同字母代表組間存在顯著差異(P<0.05)；用Origin 2018軟件繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 人乳菌落總數(shù)在儲存過程中的變化

根據(jù)人乳庫運行方針的總結,意大利人乳庫協(xié)會、法國相關法例及2010 NICE 指南等指出,菌落總數(shù)大于1×105CFU/mL被認為是質(zhì)量較差的人乳,高于此標準的人乳會被人乳庫所拒絕[22]。本研究中采集的新鮮人乳的菌落總數(shù)經(jīng)測定為(2.92±0.22)×104CFU/mL,判定初始樣品符合人乳庫標準。樣品在-18 ℃儲存7 d以內(nèi)及在4 ℃儲存4 d以內(nèi)時,與新鮮人乳相比,樣品的菌落總數(shù)均無顯著性差異；但在4 ℃儲存7 d時,樣品的菌落總數(shù)顯著增加為(25.03±2.53)×104CFU/mL(P<0.05),已超過人乳庫制定的標準。因此,如果是符合人乳庫標準的人乳建議在4 ℃下儲存時最好不要超過4 d。

圖1 不同儲存條件下人乳菌落總數(shù)的變化Fig.1 Changes of total colony number of human milk under different storage conditions

2.2 不同儲存條件下人乳脂肪含量、NEFA含量及pH值變化

人乳中脂肪是嬰兒能量的主要來源(40%～55%),且提供了嬰兒生長發(fā)育所必需的脂肪酸[23]。不同的儲存條件下脂肪含量的變化如圖2所示,隨著儲存時間的延長,人乳脂肪含量有降低的趨勢；在4 ℃儲存7 d的樣品脂肪含量顯著降低(P<0.05)。圖3和圖4表明,-18 ℃凍藏人乳的NEFA含量隨著儲存時間延長出現(xiàn)升高的趨勢,但與新鮮樣品相比,無顯著性差異,相應的pH值也無顯著變化；4 ℃冷藏人乳的NEFA含量在儲存2 d時,與新鮮樣品相比顯著增加(P<0.05),相應的pH值顯著降低(P<0.05),此結果與SLUTZAH等[24]的研究結果一致。其原因可能是人乳在儲存過程中甘油三酯在脂肪酶的作用下發(fā)生水解,導致NEFA含量增加,pH值也隨之降低[25]。

圖2 不同儲存條件下人乳脂肪含量的變化Fig.2 Changes of human milk fat content under different storage conditions

圖3 不同儲存條件下人乳NEFA含量的變化Fig.3 Changes of NEFA content in human milk under different storage conditions

圖4 不同儲存條件下人乳pH值變化Fig.4 Changes of pH value of human milk under different storage conditions

2.3 不同儲存條件下人乳脂肪球物理特性分析

2.3.1 HMFG粒徑分析

通過激光粒度分析儀測定不同儲存條件下的HMFG粒徑及其分布,結果如表1及圖5所示。從圖5可觀察到,新鮮及4 ℃冷藏后HMFG粒徑隨儲存時間發(fā)生了小幅的變化,但粒徑分布始終保持在較窄的范圍內(nèi)；表1顯示新鮮的HMFG體積平均粒徑d4,3為(4.58±0.02) μm,4 ℃冷藏2和4 d后分別為(4.64±0.07)和(4.59±0.11) μm,和新鮮樣品無顯著性差異。由圖5可知,4 ℃冷藏7 d時粒徑向右移動,根據(jù)表1可知,此時粒徑為(4.99±0.11) μm,已和新鮮樣品出現(xiàn)顯著性差異。

圖5中-18 ℃凍藏人乳粒徑分布則隨儲存時間延長逐漸變寬,新鮮樣品中體積分數(shù)占比最多(14.67%)的HMFG粒徑約4.62 μm,-18 ℃凍藏2 d后體積分數(shù)占比最多的HMFG粒徑為5.5 μm。表1顯示,-18 ℃凍藏2 d時HMFG體積平均粒徑d4,3為(4.81±0.03) μm,已經(jīng)和新鮮樣品產(chǎn)生差異；到第7 天時已經(jīng)顯著增加,為(5.87±0.14) μm。表1中體積分布≤50%的顆粒粒徑d0.5及體積分布≤95%的顆粒粒徑d0.95都顯示了與d4,3相同的粒徑變化規(guī)律。另外從表1中的粒徑分布范圍中還可以更詳細的了解到-18 ℃凍藏2、4和7 d后,HMFG的最大粒徑從新鮮樣品的18.5 μm變?yōu)?2、26.16和44 μm；4 ℃冷藏2、4和7 d后HMFG最大粒徑則都在22 μm左右；說明-18 ℃凍藏樣品的HMFG粒徑分布在不斷變寬,而4 ℃冷藏則可保持較窄的粒徑分布,這些與圖5的觀察是一致的。

圖5 不同儲存條件下的人乳脂肪球粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of HMFG under different storage conditions

表1 不同儲存條件人乳脂肪球粒徑比較 單位：μm

HMFG粒徑分析顯示,人乳在-18 ℃凍藏2 d后即出現(xiàn)顯著增加,且隨著儲存時間粒徑分布逐漸變寬,文獻指出凍藏產(chǎn)生的冰晶會導致HMFG結構破裂[12],HMFG融合堆積會導致其粒徑逐漸增大,這與TAKAHASHI等[26]的研究結果一致。HMFG具有較大的比表面積、較高的親水能力,具有良好的消化能力[27]；另外,HMFG膜表面的活性成分在腸道運輸和輸送脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)方面也起著重要作用[28]。如果HMFG結構破裂則會影響脂解率[15],進而影響嬰兒對乳的吸收,因而維持HMFG膜結構的完整性對于維持人乳的營養(yǎng)特性十分重要。本研究中儲存溫度對HMFG結構變化的影響顯示,與新鮮人乳相比,4 ℃冷藏7 d后才出現(xiàn)顯著增加,這表明,相較于-18 ℃凍藏,4 ℃短期冷藏(<4 d)可能更有利于保持HMFG膜結構的完整性。

2.3.2 HMFG的微觀結構觀察

甘油三酯以球形液滴的形式存在于人乳中,具有多分散的尺寸分布[29]。通過尼羅紅熒光標記甘油三酯,在488 nm波長下激發(fā)尼羅紅熒光探針,通過CLSM考察不同儲存條件下人乳中的甘油三酯(尼羅紅染色圖)和HMFG(明場圖)微觀結構的變化。圖6-a是CLSM觀察下的尼羅紅染色圖片,圖6-b為CLSM觀察下明場圖片。由圖可知,新鮮樣品和4 ℃冷藏樣品中HMFG的粒徑尺寸較小且大小相對均一；而-18 ℃凍藏后HMFG粒徑增大,且粒徑大小不一。圖6-c是圖6-b的局部放大圖,從圖6-c中可以更加清晰地看到,新鮮樣品的HMFG膜結構完整；而-18 ℃凍藏7 d時人乳HMFG膜結構出現(xiàn)明顯破裂和堆積融合(見圖中白色箭頭所指)。這表明2.3.1中激光粒度儀所測得的-18 ℃凍藏樣品的粒徑變大和分布變寬是因為HMFG結構破裂并發(fā)生堆積和融合造成的。人乳在-18 ℃凍藏時會產(chǎn)生冰晶,冰晶可能刺破HMFG膜[12],導致脂肪球相互融合堆積；這導致了HMFG的粒徑增大,且數(shù)量同步減少。

a-尼羅紅染料染色圖片；b、c-明場顯微圖片圖6 不同儲存條件下HMFG的微觀結構Fig.6 Microstructure of HMFG under different storage conditions

2.4 儲存條件對人乳風味的影響

2.4.1 GC-MS測定人乳揮發(fā)性風味

通過固相微萃取頭對人乳中的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行萃取,而后利用GC-MS進行鑒定分析,結果見表2。隨著儲存時間的延長,人乳樣品中的酸類和醛類物質(zhì)在不同儲存溫度下產(chǎn)生的變化具有一定的差異性,-18 ℃凍藏樣品中兩者皆少量增加；而4 ℃冷藏人乳中兩者則相對增加較多,其中酸類物質(zhì)顯著增加。有研究表明,凍藏過程中冰晶刺破HMFG膜會導致脂肪在脂肪酶的作用下發(fā)生分解[12],揮發(fā)性的酸類物質(zhì)含量逐漸增加,酸類物質(zhì)繼續(xù)氧化就會產(chǎn)生醛類物質(zhì)；因此隨著凍藏時間的延長,人乳中酸類和醛類物質(zhì)含量逐漸增多。但是,此類研究的凍藏期一般較長(2～6個月)[6],而本實驗主要研究0 ～7 d內(nèi)人乳樣品的變化,雖然在儲存的第4 天即觀察到-18 ℃凍藏樣品的HMFG結構發(fā)生破裂,至第7 天時可以觀察到明顯的破裂,但由于0～7 d仍屬于非常短的儲存時間,因凍藏導致的HMFG膜破裂繼而脂肪在脂肪酶作用下發(fā)生分解可能需要更長時間的累積其效應才能體現(xiàn),因此可能不是本研究中導致冷藏人乳風味劣變的主要原因；本研究中4 ℃冷藏樣品HMFG膜結構保持相對較完整,其風味劣變更顯著,這是因為由微生物脂肪酶促進的脂類分解才是其風味劣變的主要誘因[30],由于4 ℃冷藏7 d的樣品中菌落總數(shù)顯著增加,微生物越多,其代謝產(chǎn)物中的脂肪酶也越多,因此觀察到了顯著的風味劣變。從表2中也可看到,此時4 ℃冷藏人乳中酸類和醛類物質(zhì)增加較多,而-18 ℃凍藏樣品的酸類和醛類物質(zhì)僅呈現(xiàn)少量增加。

表2 GC-MS分析不同儲存條件人乳的揮發(fā)性風味物質(zhì) 單位：μg/L

續(xù)表2

通過PCA圖可看出不同揮發(fā)性風味物質(zhì)種類對不同人乳樣品的分類貢獻的關系,圖中樣品間的距離遠近可以反映出樣品間的相似性高低[20-21]。本研究選擇人乳樣品中含量較高、對風味貢獻較大的物質(zhì)種類(即酸、醛、酮和酯)進行PCA,描述不同樣品之間的整體風味是否相似,以及不同的揮發(fā)性風味物質(zhì)對區(qū)分樣品間整體風味差異的貢獻。從圖7的PCA可知,F1貢獻率為66.34%,F2的貢獻率為15.29%,兩者整體貢獻率>80%(81.63%),包含了樣品酸、酯、醛及酮等風味的絕大多數(shù)信息[31]。

圖7 不同儲存條件下人乳主要揮發(fā)性物質(zhì)PCA圖Fig.7 PCA plot of volatile substances in human milk under different storage conditions

由F1可知,己酸、正癸酸、庚酸等在顯示樣品風味差異性上的作用更為明顯,其次是月桂酸、正辛醛及3-十一酮等；由F2可知,巴豆酸正丁酯、乙酸丙酯等在顯示樣品風味差異性上的作用更為明顯；4 ℃儲存2 d及凍藏后的樣品與新鮮樣品距離更為接近,4 ℃儲存7 d的樣品與新鮮樣品距離較大,說明冷藏2 d及短期凍藏后樣品的整體風味與新鮮樣品的相似性更高。

2.4.2 電子舌分析不同低溫處理人乳的滋味

利用電子舌檢測不同儲存條件下人乳樣品的味覺信號,并對結果進行PCA,結果如圖8所示。其中F1貢獻率為64.09%,F2貢獻率為23.31%,兩者整體貢獻率大于80%(87.40%),包含了樣品味覺信號的絕大多數(shù)信息。從F1來看,豐富度、苦味回味及澀味在顯示母乳味覺信號差異性上的作用更為明顯,其次是甜味、苦味等；從F2來看,鮮味在顯示母乳味覺信號差異性上的作用更為明顯,其次是澀味回味。

圖8 不同條件儲存人乳后滋味的PCA圖Fig.8 PCA plot of post-storage taste of human milk under different storage conditions

根據(jù)圖8中各樣品與新鮮樣品之間的距離,4 ℃冷藏人乳2 d和-18 ℃凍藏2 d人乳都能顯示出與新鮮人乳非常相似的滋味豐富度,這一結論與GC-MS風味的PCA相似。但是,隨著儲存時間的延長,4 ℃冷藏人乳整體滋味的劣化稍甚于-18 ℃凍藏人乳,表現(xiàn)出更多的苦味、咸味和澀味,與新鮮樣品滋味的相似度也更低。

3 結果與討論

根據(jù)研究結果,新鮮人乳在4 ℃下冷藏7 d時菌落總數(shù)顯著性增加,超過人乳庫推薦標準[22],不建議食用；在-18 ℃凍藏7 d內(nèi)無顯著性變化。隨著儲存時間的延長,人乳脂肪含量在4 ℃冷藏及-18 ℃凍藏條件下均有降低趨勢,但僅在4 ℃儲存7 d時顯著降低(P<0.05)。與新鮮樣品相比,4 ℃冷藏人乳的NEFA含量在儲存2 d時顯著增加(P<0.05),相應的pH值顯著降低(P<0.05)；隨著儲存時間延長,-18 ℃凍藏人乳的NEFA含量出現(xiàn)升高的趨勢,但與新鮮樣品相比,無顯著性差異,相應的pH值也無顯著變化。由此推測,溫度越低越能抑制微生物的增殖,抑制脂肪酶的活性從而延緩脂肪分解。

與新鮮人乳相比,4 ℃冷藏人乳7 d時其d4,3值出現(xiàn)顯著性增加,粒徑分布范圍基本無變化,HMFG膜無明顯破裂,但此時菌落總數(shù)已超標；而-18 ℃凍藏人乳的d4,3值在儲存2 d時顯著增加,粒徑分布范圍變寬,且HMFG膜結構在儲存4 d時可觀察到破裂,7 d時破裂更為明顯,這可能是由凍藏后冰晶的形成刺破了HMFG膜,引起HMFG的融合堆積造成的。隨著儲存時間的延長,4 ℃冷藏人乳的揮發(fā)性風味物質(zhì)含量逐漸增加,其中以酸類物質(zhì)最為顯著,這可能是由于微生物代謝產(chǎn)生的脂肪酶促進了脂類的分解反應,造成脂肪酸敗引起的；而-18 ℃凍藏后人乳的各類風味物質(zhì)變化較大的也是酸類物質(zhì),這可能是由于凍藏后冰晶的產(chǎn)生刺破了HMFG膜,導致HMFG膜吸附的脂肪酶與膜內(nèi)的甘油三酯相互作用,導致脂肪分解,但由于儲藏時間較短,HMFG膜破損的程度較低,另外較低的儲藏溫度也在一定程度延緩了脂肪分解反應,因此18 ℃凍藏后人乳中的風味物質(zhì)含量及種類并未發(fā)生顯著變化。PCA也表明,-18 ℃短期凍藏后人乳的整體風味(氣味和滋味)與新鮮人乳更為相似,但本研究表明凍藏后HMFG粒徑增大,HMFG膜結構破裂,可能會影響嬰兒對人乳脂質(zhì)的消化吸收。因而,未來人乳低溫儲存的研究方向可關注既能延緩脂質(zhì)分解又能避免冰晶產(chǎn)生導致HMFG破裂從而影響人乳營養(yǎng)特性的溫度帶。