田苗新,邵君琳,王光強,熊智強,張匯,宋馨,艾連中,夏永軍

(上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院,上海食品微生物工程技術研究中心,上海,200093)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種慢性的、反復發(fā)作的腸道炎癥疾病。IBD主要包括克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)兩種表型[1]。IBD發(fā)病機制是多因素的,包括腸上皮屏障破壞、免疫應答紊亂、腸道菌群變化等[2],但具體發(fā)病機制仍不清楚。在治療IBD過程中服用的藥物會引起多種副作用[3]。因此,研究IBD發(fā)病機制并探索降低治療副作用的方法至關重要。

益生菌是緩解IBD的有效途徑。益生菌可通過改善腸道屏障、降低腸道pH、調節(jié)腸道菌落組成等方式緩解結腸炎癥狀[4]。益生菌攝入可調整腸道菌群多樣性,改善結腸炎引發(fā)的生態(tài)失調[5-6]。但高劑量攝入益生菌會加重小鼠結腸炎[7]。益生菌調節(jié)腸道菌群對機體產生影響的機理尚不清楚。結腸炎發(fā)病過程中,腸道受到外來物或致病菌刺激,導致腸道屏障、炎癥水平等發(fā)生顯著改變?？股赝ㄟ^干擾腸道菌群,改變腸道敏感性,降低腸道菌群復雜性,達到治療疾病的目的,但抗生素的攝入會干擾腸道菌群定殖能力,與益生菌聯(lián)合服用可能導致復雜的相互作用,改變腸道代謝及免疫[8-9]。

前期研究表明,植物乳桿菌AR113可以較好地緩解葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導的結腸炎癥狀,通過調節(jié)TLR4-NF-κB途徑降低腸道炎癥水平,改善腸道菌群組成,維持腸道屏障完整性[10]。本文考察青霉素干預及青霉素與植物乳桿菌AR113聯(lián)合處理對小鼠結腸炎的影響,為解析植物乳桿菌AR113緩解結腸炎奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

C57BL/6 J小鼠,SPF級,日齡28～35 d,由上海杰斯捷實驗動物有限公司(中國上海)提供,許可證號：SCXK(滬)2013—0006。

1.2 實驗菌株

植物乳桿菌AR113篩選自四川泡菜,保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC),菌種保藏號：No.13909。

1.3 實驗主要試劑

葡聚糖硫酸鈉(MW：36 000～50 000),MP Biomedicals；便隱血試劑盒,貝索企業(yè)；5-氨基水楊酸,源葉生物；青霉素G鈉鹽、Trizol,生工生物；髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)試劑盒,南京建成；反轉錄試劑盒,南京諾唯贊;qPCR SYBR Green Master Mix,翊圣生物；引物由華大基因合成。

1.4 主要儀器設備

RM 2016病理切片機,德國Leica；JK-6組織攤烤片機,武漢俊杰；E100顯微鏡,尼康；550D數(shù)碼單反相機,佳能；L500低速離心機,湖南湘儀；Nano Drop 2 000分光光度計,Thermo Scientific；S1000梯度PCR儀,美國伯樂Bio-rad；LightCycler96實時熒光定量PCR儀,羅氏制藥。

2 實驗方法

2.1 動物分組及處理

雄性C57BL/6J小鼠適應性喂養(yǎng)一周，每籠8只，飼養(yǎng)溫度(22 ± 2)℃，相對濕度(50±5)%，循環(huán)12 h光照/黑暗。動物實驗選用3% DSS造模。48只小鼠隨機分為6組，分別為正常組(Control)、模型組(DSS)、陽性對照組(DSS+5-ASA)、AR113組(DSS+AR113)、青霉素干預組(DSS+Pen)、青霉素與AR113聯(lián)合組(DSS+Pen+AR113)(青霉素干預后灌胃植物乳桿菌AR113)。

小鼠適應1周后，青霉素干預組、青霉素與AR113聯(lián)合組自由飲用1 g/L的青霉素鈉鹽水溶液3周，其余各組飲用無菌水3周。隨后所有實驗組自由飲用無菌水3 d后，小鼠自由飲用3% DSS水溶液造模7 d，造模第5天開始到第14天，陽性對照組灌胃5-氨基水楊酸(5 g/L)，AR113組、青霉素與AR113聯(lián)合組灌胃植物乳桿菌AR113(1×109CFU/mL)，其余各組灌胃無菌水。本研究遵循動物試驗委員會所制訂的倫理學標準，批準文號為倫審-KYSB-2016-97。實驗流程如圖1所示：

圖1 實驗流程圖Fig.1 Experimental protocols

2.2 小鼠疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)的測定

DAI評分基于 MURTHY 評分系統(tǒng)[11]。DAI 包括3個部分：體重變化、便血情況和糞便性狀。選用便隱血試劑盒測糞便中的潛血。具體評分標準如表1所示：

表1 疾病活動指數(shù)評分標準Table 1 Disease activity index scoring standards

2.3 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，H&E)染色及阿利新藍染色

采用阿利新藍將結腸黏液層的黏蛋白染成藍色,評估結腸黏蛋白變化[12]。H&E 對結腸染色進行形態(tài)學評估[13]。根據(jù)炎癥、隱窩損傷程度、黏膜損傷和病變范圍對H&E染色照片進行組織損傷評分。組織損傷評分標準如表2所示：

表2 組織損傷評分標準Table 2 Histological score standards

2.4 MPO測定

根據(jù)南京建成MPO試劑盒說明書進行測定。

2.5 結腸組織mRNA表達量測定

Trizol法提取結腸組織總RNA,根據(jù)反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。根據(jù)qPCR SYBR Green Master Mix使用說明對腸道相關基因進行PCR擴增和檢測。所涉及的引物序列如表3所示,以β-actin作為內參,采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表3 引物序列Table 3 Primer sequence

2.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),實驗結果均采用均值±標準偏差(Mean±SD)表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果與討論

3.1 小鼠DAI與體重變化

DAI表征小鼠結腸炎發(fā)展狀況。研究結果顯示(圖2),隨著DSS攝入,模型組小鼠體重逐漸降低,AR113組與陽性對照組能夠顯著減緩小鼠體重降低。但青霉素干預組與聯(lián)合處理組在實驗周期內體重無顯著降低,變化趨勢與正常組小鼠一致(圖2-a)。與模型組小鼠相比,AR113組能夠顯著降低結腸組織DAI評分,而青霉素干預組以及聯(lián)合處理組DAI評分變化無顯著差異,顯著低于模型組以及AR113組,變化趨勢與正常組接近(圖2-b),這與體重監(jiān)測結果一致。實驗結束時,各組小鼠體重與DAI存在顯著差異(圖2-c、d)。

a-實驗周期內小鼠體重變化；b-實驗周期內小鼠DAI變化；c-實驗結束時各組小鼠體重差異；d-實驗結束時各組小鼠DAI差異圖2 青霉素與植物乳桿菌AR113對小鼠體重及疾病活動指數(shù)的影響Fig.2 Effects of penicillin and Lactobacillus plantarum AR113 on body weight and disease activity index of mice

3.2 青霉素及植物乳桿菌AR113對腸道活性及結腸長度影響

MPO是只存在于中性粒細胞和單核細胞中的顆粒血紅素酶。中性粒細胞是急性炎癥的標志,當病原體侵入時,中性粒細胞將病原體吞噬,保證機體的正常運行[14]。故檢測結腸中MPO活性表征小鼠結腸炎癥程度。研究結果表明,模型組小鼠MPO活性顯著升高,AR113組MPO活性最低；青霉素干預組與聯(lián)合處理組也能夠顯著降低MPO活性,可使其恢復到正常組水平且兩組間無顯著差異(圖3-a)。結腸長度變化可表征小鼠炎癥程度。模型組小鼠結腸長度顯著降低,與MPO結果相一致,青霉素干預組以及聯(lián)合處理組得到有效緩解,結腸長度恢復到正常水平(圖3-b)。

a-小鼠結腸MPO活性；b-結腸長度圖3 青霉素與植物乳桿菌AR113對小鼠結腸MPO 活性及結腸長度的影響Fig.3 Effects of penicillin and L.plantarum AR113 on MPO activity and colon length in mouse colon

3.3 結腸組織H&E染色及組織損傷評分

小鼠攝入DSS后引起結腸組織發(fā)生炎癥反應,如圖4-a所示。模型組結腸上皮組織結構破壞,中性粒細胞數(shù)量增多,出現(xiàn)隱窩消失。灌胃AR113后,小鼠結腸上皮組織結構恢復良好,顯著減少中性粒細胞數(shù)量,與DIN等[15]研究結果一致。青霉素干預組以及聯(lián)合處理組小鼠結腸組織同樣得到良好恢復。組織評分顯示(圖4-b),模型組組織損傷評分顯著高于對照組,灌胃AR113后組織損傷程度降低,而經過青霉素以及聯(lián)合治療后,小鼠結腸組織損傷程度最低,且兩者無顯著差異。

a-結腸HE染色圖;b-結腸組織損傷評分 1-正常組；2-模型組；3-陽性對照；4-AR113組；5-青霉素干預； 6-青霉素與AR113聯(lián)合圖4 青霉素與植物乳桿菌AR113對小鼠結腸組織的影響Fig.4 Effects of penicillin and L.plantarum AR113 on mouse colon tissue

3.4 青霉素及植物乳桿菌AR113對腸道上皮黏液層影響

腸道上皮黏液層對腸道組織具有保護作用,是一個由黏液蛋白組成的復雜結構。其中黏蛋白MUC2是由腸道上皮組織杯狀細胞分泌,用于保護腸道及維持腸道穩(wěn)態(tài)[16]。阿利新藍可與MUC2結合,表征腸道上皮黏蛋白含量[17]。由圖5-a可知,由于模型組結腸上皮組織結構被破壞,大量杯狀細胞損傷,導致黏蛋白分泌量明顯減少,與H&E染色與組織損傷評分結果一致。灌胃AR113后,結腸組織結構恢復,黏蛋白MUC2含量明顯增加；與模型組相比,青霉素干預組與聯(lián)合處理組黏蛋白MUC2含量也出現(xiàn)增加,但是含量低于AR113組。qPCR結果顯示(圖5-b),灌胃AR113黏蛋白合成基因MUC2表達量顯著上升,且表達量在各組中最高,黏蛋白含量顯著增加。青霉素干預組以及聯(lián)合處理組經過治療后,黏蛋白合成基因MUC2表達量恢復到正常水平,且兩組間無顯著差異?？股靥幚砗?服用植物乳桿菌AR113不會干擾腸道上皮細胞黏液層恢復,但抗生素會降低黏液層的恢復效果。

a-結腸阿利新藍染色;b-結腸MUC2蛋白相對表達水平 1-正常組；2-模型組；3-陽性對照；4-AR113組；5-青霉素干預； 6-青霉素與AR113聯(lián)合圖5 青霉素與植物乳桿菌AR113對小鼠結腸黏液層的影響Fig.5 Effects of penicillin and L.plantarum AR113 on mucus layer of mouse colon

3.5 青霉素及植物乳桿菌AR113對結腸炎癥因子水平影響

機體正常狀態(tài)下,免疫系統(tǒng)維持穩(wěn)態(tài)。當機體受到外界干擾時,免疫細胞受刺激,釋放炎癥因子作為信號分子,刺激相關細胞調節(jié)機體免疫,使機體恢復正常狀態(tài)[18-19]。如圖6所示,DSS造模后,模型組小鼠結腸組織損傷,促炎因子TNF-α、IL-6表達顯著增加(圖6-a、b),抑炎因子IL-10表達量有一定降低(圖6-c),但不顯著。灌胃AR113后,小鼠促炎因子TNF-α、IL-6表達顯著降低(圖6-a、b),抑炎因子IL-10表達顯著升高(圖6-c)。青霉素干預組以及聯(lián)合處理組治療后,炎癥因子變化趨勢無顯著差異,兩組均能夠顯著降低TNF-α基因表達量(圖6-a),且表達水平顯著低于AR113組,但是抑炎因子IL-10表達水平顯著低于AR113組(圖6-c)。利用無菌小鼠進行DSS造模,小鼠無明顯結腸炎癥狀,而正常小鼠則出現(xiàn)嚴重結腸炎癥狀,說明腸道菌群可能介導小鼠結腸炎發(fā)病[20]。SOVRAN等[21]研究表明,抗生素可顯著影響真菌對DSS誘導小鼠腸炎模型的治療效果。分析腸道菌群顯示,真菌治療效果受腸桿菌影響。萬古霉素處理小鼠后,殺滅腸道中的腸桿菌,造成小鼠對DSS誘導不敏感,降低結腸炎發(fā)病率。因此,青霉素攝入可能通過有效降低促炎菌群,從而抑制促炎因子的表達,降低炎癥水平[22]。

a-TNF-α mRNA相對表達水平；b-IL-6 mRNA相對表達水平； c-IL-10 mRNA相對表達水平圖6 青霉素與植物乳桿菌AR113對小鼠結腸炎癥因子表達水平的影響Fig.6 Effects of penicillin and L.plantarum AR113 on the expression of inflammatory factors in the colon of mice

4 結論

益生菌與抗生素常用于炎癥性腸病緩解治療,兩者治療腸炎作用機制有所差異。植物乳桿菌AR113可以有效緩解小鼠結腸炎癥,恢復損傷的杯狀細胞,增加黏蛋白MUC2分泌,同時顯著提升小鼠結腸抑炎因子IL-10表達,激活腸道免疫系統(tǒng)。青霉素干預組與聯(lián)合處理組小鼠結腸癥狀以及大部分指標并無明顯差異,均能夠有效降低結腸促炎因子TNF-α表達,恢復腸道黏液層。青霉素干預處理在一定程度上鈍化DSS誘導結腸炎敏感性。但與灌胃AR113相比,青霉素處理會降低杯狀細胞恢復,影響?zhàn)さ鞍譓UC2分泌,并降低結腸抑炎因子表達。益生菌攝入能夠有效恢復結腸炎癥狀,在一定程度上能夠替代抗生素對結腸炎的治療。