楊柳,高良鋒,沈明浩,姜斌,任大勇

(吉林農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院,吉林 長春,130118)

辣白菜作為東北地區(qū)具有民族特色的開胃菜,以白菜為基本原料[1],辣椒粉、蒜、姜、鹽、蔗糖等為基本輔料[2],在自然條件下低溫發(fā)酵而成,以其辣,脆、酸、甜的特點而廣受大眾喜愛。根據(jù)傳統(tǒng)工藝進行辣白菜的腌制,發(fā)酵7～14 d得到成品[3]。辣白菜在發(fā)酵過程中,微生物的菌群結(jié)構(gòu)[4-5]對辣白菜品質(zhì)和風味[6]具有重要影響,在微生物代謝的幫助下,白菜中大分子營養(yǎng)物質(zhì)變成更容易被人體所吸收的小分子物質(zhì),如還原糖、氨基酸等,同時使辣白菜具有獨特的風味[7]。

辣白菜發(fā)酵過程中以乳酸菌[8]代謝為主,這類微生物的多樣性結(jié)構(gòu)顯著地影響著還原糖、氨基酸、乙酸和乳酸等呈味物質(zhì)[9],目前,關(guān)于辣白菜發(fā)酵過程中微生物結(jié)構(gòu)[10]與呈味物質(zhì)間的相關(guān)性還不清楚。如今高通量測序技術(shù)已被證明是探索復(fù)雜環(huán)境微生物和跟蹤發(fā)酵過程的有效研究手段[11],可以更客觀地揭示食品發(fā)酵過程中微生物多樣性[12]的變化,并且此項技術(shù)已被應(yīng)用于泡菜發(fā)酵過程中微生物演替的研究。本研究在控制溫度、鹽度[13]、發(fā)酵時間等條件不變的條件下,測定了還原糖、氨基酸、總酸等主要呈味物質(zhì)的含量,利用高通量測序技術(shù)探究辣白菜在發(fā)酵過程中的菌群結(jié)構(gòu),利用主成分分析探究兩者相關(guān)性[14-15]。

1 材料與方法

1.1 材料

白菜、辣椒粉、蒜、姜、蘋果、鹽、蔗糖,市售；平板計數(shù)培養(yǎng)基,青島海博；NaOH、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、堿性酒石酸銅、鹽酸、甲氧基胺、甲醇、三甲基氯硅烷、三氟乙烷、乙醇(分析純),北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

PH3-3C型pH儀,上海佑科儀器儀表有限公司；臺式冷凍離心機,德國 Eppendorf 公司；磁力加熱攪拌器,上海達理儀器廠；氣相色譜6890 N,美國安捷倫公司。

1.3 辣白菜的制作

辣白菜根據(jù)現(xiàn)有的傳統(tǒng)工藝,以新鮮的白菜為原料,以蒜、辣椒粉、姜、蘋果等材料制作成糊狀醬料[19]。使用白菜質(zhì)量4%的食鹽腌制白菜后，將醬料在菜葉上涂勻,裝入塑料盒中保持在10 ℃下發(fā)酵。在發(fā)酵的第1天、第4天、第7天、第11天和第14天各取1次樣品檢測相關(guān)指標,選取第1天、第7天和第14天的樣品進行菌群結(jié)構(gòu)檢測以及主要呈味物質(zhì)含量的檢測，第1天、第7天和第14天的樣品分別編號為N1、N4和N7。

1.4 還原糖測定

稱取打碎的5 g樣品于容量瓶中稀釋定容,加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液再次定容后,過濾取濾液,利用堿性酒石酸銅溶液滴定濾液至溶液藍色消失為滴定終點,利用平均耗用體積來計算還原糖的含量(以葡萄糖計)。

1.5 可滴定酸及氨基酸態(tài)氮含量檢測

稱取10 g糊狀樣品于容量瓶稀釋定容,在磁力攪拌器的作用下使用標準NaOH溶液進行滴定,通過NaOH溶液體積計算可滴定酸(總酸)含量。用滴定法檢測總酸后,再加入甲醛溶液繼續(xù)用標準NaOH滴定溶液滴定,記錄標準NaOH滴定溶液的體積,用于計算氨基酸態(tài)氮含量。

1.6 氣相色譜法檢測乳酸、乙酸含量

使用氣相色譜儀,采用DB-5 ms毛細管柱(30 m×0.25 mm,膜厚0.25 μm)分離樣品,以15 ℃/min升高至240 ℃,運行26 min。進樣溫度240 ℃,載氣He,流速1 mL/min[20]。

1.7 菌群結(jié)構(gòu)分析

采用 CTAB 或SDS方法對樣本的基因組 DNA 進行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度,取適量的樣本DNA于離心管中,使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組 DNA 為模板,根據(jù)測序區(qū)域的選擇,使用帶 Barcode 的特異引物New England Biolabs 公司的 Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer,和高效高保真酶進行PCR,確保擴增效率和準確性。PCR產(chǎn)物使用2%(質(zhì)量分數(shù))的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣,充分混勻后使用1×TAE 2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物,剪切回收目標條帶。產(chǎn)物純化試劑盒使用的是Thermo Scientific 公司GeneJET 膠回收試劑盒回收產(chǎn)物,測序由北京諾禾致源科技股份有限公司進行。

1.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

本次實驗進行6次平行試驗,所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。使用SPSS 20.0軟件以單因素方差分析(ANOVA)分析數(shù)據(jù)。Tukey的數(shù)據(jù)測試使用Graphpad 8.0進行。組間的顯著差異用Tukey的平均值檢驗,置信度為95%(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 理化指標

2.1.1 還原糖測定

糖是發(fā)酵過程中微生物生長繁殖的重要碳源及能量來源[21],辣白菜在發(fā)酵過程中還原糖含量變化如圖1所示,相對于第1天,發(fā)酵4和7 d還原糖含量未顯著增加,發(fā)酵14 d還原糖含量顯著增加。在制作辣白菜時,配料中人為添加了蔗糖,為發(fā)酵過程提供了微生物代謝所需要的碳源,隨著發(fā)酵過程中微生物數(shù)量的增加,蔗糖等大分子糖數(shù)量有限,分解到一定程度后不再分解,因而還原糖數(shù)量上升速度減慢。

圖1 發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.1 Changes in reducing sugar content during fermentation 注：*表示與第1天相比差異顯著,P<0.05；**表示 與第1天相比差異極顯著P<0.01(下同)

2.1.2 可滴定酸含量檢測

有機酸作為辣白菜的揮發(fā)性特征風味之一,可以利用可滴定酸的含量來衡量辣白菜的成熟度?？傻味ㄋ岷孔兓鐖D2所示,可滴定酸含量逐漸升高,相對第1天,發(fā)酵7、11、14 d可滴定酸含量極顯著增加,可滴定酸顯示發(fā)酵過程中總酸含量變化,從可滴定酸的變化可推測出有一定數(shù)量產(chǎn)酸的微生物參與到發(fā)酵中,并且隨著酸含量的增加,微生物[18]將呈現(xiàn)產(chǎn)酸微生物或耐酸微生物變化。

圖2 發(fā)酵過程中可滴定酸的變化Fig.2 Change of titratable acid during fermentation

2.1.3 氨基酸含量檢測

由于氨基酸不能直接測定,但可通過測氨基酸氮的含量代替檢測樣品分解、代謝氨基酸的含量[19]。如圖3所示,氨基酸氮的含量隨著發(fā)酵時間延長而增加,相比第1天,發(fā)酵14 d之前氨基酸氮的含量未有顯著增加,發(fā)酵14 d氨基酸氮含量具有極顯著增加。氨基酸含量不斷增加,也說明了辣白菜中含有的大分子蛋白質(zhì)類物質(zhì)在不斷降解,微生物利用蛋白質(zhì)為氮源進行生長繁殖。

圖3 發(fā)酵過程中氨基酸含量的變化Fig.3 Change of amino acid content during fermentation

2.2 有機酸含量測定

辣白菜中主要的有機酸包括乳酸、乙酸、檸檬酸等,其中乳酸給人柔和的感覺,乙酸給人刺激的感覺[18-19],作為辣白菜在發(fā)酵過程中主要的呈味物質(zhì)[15],其在發(fā)酵過程中含量變化與呈味有著密切的關(guān)系。如圖4所示,樣品中的乳酸和乙酸的含量不斷增加,第7天相對第1天的乳酸含量顯著性增長,14 d時乳酸含量具有極顯著增長；第7天相對第1天乙酸含量增長不顯著,14 d時乙酸含量極顯著增長。隨著乳酸和乙酸含量的增加,對辣白菜的風味有著重要的影響,對總酸含量的變化也起到重要作用。

a-乳酸含量；b-乙酸含量圖4 發(fā)酵過程中乳酸和乙酸含量變化Fig.4 Change of lactic acid and acetic acid content during fermentation

2.3 發(fā)酵過程中的菌群結(jié)構(gòu)測定

2.3.1 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性可用于分析樣品內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性[20],采用Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和覆蓋率(goods_coverage)對樣品微生物物種的豐富度和多樣性進行評估。樣品的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和覆蓋率反映了樣品的多樣性、相對豐度和測序深度,Shannon指數(shù)表示豐富度和均勻度,Shannon指數(shù)越高,表明群落的多樣性越高；Chao1指數(shù)表示群落的豐度指數(shù),Chao1指數(shù)越大,表明群落的豐富度越高；覆蓋率反映樣本的真實情況,覆蓋率指數(shù)越高,則樣本中序列未被測出的概率越低。由表1可知,微生物覆蓋率大于0.999,說明樣品序列基本上被測出,即樣本測序結(jié)果可以反映樣品真實情況；N1組的Shannon指數(shù)最高,N4和N7組的Shannon指數(shù)降低,發(fā)酵過程中微生物的豐富度下降；N1組、N4組、N7組的Chao1指數(shù)越來越小,說明樣品中的微生物的相對豐度降低。根據(jù)已知的Shannon 指數(shù)以及Chao1指數(shù)的變化趨勢可以表明,發(fā)酵過程中,與N1組相比較,N4組與N7組微生物的相對豐度有顯著性的下降趨勢,說明發(fā)酵1 d時,微生物群落組成上最豐富,隨著發(fā)酵的進行,微生物群落多樣性降低。

表1 Alpha多樣性分析Table 1 Microbial Alpha diversity index of samples

2.3.2 辣白菜發(fā)酵過程中物種豐度變化

Venn圖能夠直觀表現(xiàn)出樣品中獨有和共有操作分類單元 (operational taxonomic units，OTU)數(shù)目,同時也能夠較直觀地表現(xiàn)樣本的 OTU 數(shù)目組成相似性及重疊情況[21],在發(fā)酵不同階段 OTU 數(shù)目的重疊情況如圖5-a所示,3組樣品共有OTU數(shù)目為170,N1 組獨有OTU 數(shù)目為373,N4組獨有OTU數(shù)目為12,N7組樣品中的獨有 OTU 數(shù)量降低至 4?？梢园l(fā)現(xiàn)物種豐度最大值出現(xiàn)在發(fā)酵初始階段,此時的總OTU數(shù)量為699,隨著發(fā)酵時間的延長不僅總OTU數(shù)量下降,獨有OTU數(shù)量也急速下降,N7組的總OTU數(shù)量下降至222,說明在辣白菜發(fā)酵過程中,樣品中微生物物種豐度下降。

a-Venn圖;b-稀釋度曲線;c-Rank-abundance 曲線圖5 辣白菜發(fā)酵過程中物種豐度Fig.5 Species abundance of samples during kimchi fermentation

稀釋曲線可以直接反映數(shù)據(jù)合理性,也可間接反映樣本物種的豐富程度,稀釋度曲線中隨著序列數(shù)增加到60 000,OTU數(shù)量趨于穩(wěn)定,證明測序數(shù)據(jù)的合理性,同時OTU數(shù)量越多,微生物的相對豐度越高,菌群結(jié)構(gòu)越復(fù)雜,反之OTU數(shù)量減少說明微生物的相對豐度降低,菌群結(jié)構(gòu)相對簡單。如圖5-b所示,整個發(fā)酵過程中OTU數(shù)量呈下降趨勢,在發(fā)酵的初始階段,N1 組樣品曲線最為陡峭,縱坐標OTU數(shù)量范圍也最大,表明發(fā)酵的第1天微生物種類最為復(fù)雜,但隨著發(fā)酵的進行,OTU數(shù)量出現(xiàn)了迅速下降,發(fā)酵7 d的OTU數(shù)量幾乎與發(fā)酵14 d時的OTU數(shù)量相近,說明發(fā)酵第1天的菌群結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜,微生物種類繁多,隨著發(fā)酵的進行,微生物種類逐漸降低,菌群結(jié)構(gòu)也變得簡單。

Rank-abundance曲線可以清晰地顯示出發(fā)酵過程中的物種豐度和物種均勻度等級,聚類曲線可直觀地反映樣本中微生物物種的豐度及均勻度。如圖5-c所示,水平方向上,微生物物種的豐度由曲線的寬度來反映；垂直方向上,曲線的平滑程度反映樣本中微生物物種的均勻程度,N1 組樣品中微生物豐度最高,分布相對均勻,OTU 在200～600分布較為均勻,而N4和N7組的曲線較為陡峭,說明樣品中微生物分布均勻度逐漸降低,發(fā)酵過程中微生物的相對豐度隨時間的增加而降低,OTU在0～200有3組相對豐度數(shù)值較為接近,與Venn圖當中N1、N4、N7組共有部分相關(guān)。

2.3.3 辣白菜發(fā)酵過程中微生物菌群組成

選取分組在屬水平上最大豐度排名前10的物種,生成物種相對豐度柱形累加圖,以便直觀查看各樣本在不同分類水平上,相對豐度較高的物種及其比例。圖6-a是在屬的水平下,N1、N4、N7 豐度水平前10的物種,其他物種合并為others,圖6-b顯示了N1、N4、N7各組每個樣品在發(fā)酵過程中屬水平上相對豐度前10的物種。通過圖6-a、6-b可知,發(fā)酵的第1天,樣品中微生物以Virgibacillus屬和Weissella屬為主,Weissella屬是在整個發(fā)酵階段一直穩(wěn)定的優(yōu)勢菌屬,隨著發(fā)酵的進行,在發(fā)酵第7天達到93.47%,在發(fā)酵第14天達到 96.91%,而Virgibacillus屬的相對豐度逐漸減少。此外,樣品中被檢出的相對豐度位于前10的還有Lentibacillus、unidentified_Rhizobiaceae、unidentified_Cyanobacteria、Pantoea、Sphingomonas、Stenotrophomonas、unidentified_Rickettsiales和Alkalibacillus等。

菌群熱圖是通過顏色梯度及相似程度來反映多個樣品在各分類水平上群落組成的相似性和差異性,圖6-c顯示了N1、N4、N7 在屬水平上的菌群熱圖,每個樣品中前25種微生物物種相似性和差異性。在發(fā)酵的第1天,物種的相對豐度都較為豐富,當發(fā)酵到第7天時,樣品的微生物豐度大部分下降,以Leuconostoc,Lactobacillus,Weissella和Lactococcus為主,當發(fā)酵到第14天時,樣品中的Weissella屬的相對豐度顯著性增加,其他各菌屬的相對豐度均減少。

a、b-豐度；c-屬水平熱圖圖6 細菌豐度各組樣品屬水平熱圖Fig.6 Bacterial abundance heatmap of each group at genus level

2.3.4 發(fā)酵過程微生物豐度及分布

為了研究不同類群之間的相似性,使用非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean,UPGMA)進行聚類分析,并將聚類分析結(jié)果與門級每組的物種相對豐度相結(jié)合。如圖7所示,3組樣品中主要顯示了11 個門類菌群,分別為Firmicutes、Proteobacteria、Cyanobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Nitrospirae、Chloroflexi、Acidobacteria、Verrucomicrobia、Gemmatimonadetes、others。其中Firmicutes相對豐度占絕對優(yōu)勢,隨著發(fā)酵的進行,Proteobacteria的相對豐度降低,通過聚類分析可知N4和N7歐里距離最近,其微生物種類和數(shù)量最為相似,說明在發(fā)酵第7天和第14天的菌群結(jié)構(gòu)相似,也符合細菌豐度圖與菌群熱圖的結(jié)果分析。

圖7 基于Unweighted Unifrac距離的UPGMA聚類樹Fig.7 UPGMA clustering tree based on unweighted unifrac distance

2.3.5 發(fā)酵過程菌群主坐標分析

主坐標分析可呈現(xiàn)研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化坐標,是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維分析方法,可用來研究樣本群落組成的相似性或相異性[22]。對3組樣品進行分析,結(jié)果如圖8所示,第1主成分和第2主成分的貢獻率分別為98.20%,0.84%,在加權(quán)和非加權(quán)主坐標分析中所選主成分均可以充分解釋原始數(shù)據(jù)中的差異,通過圖中樣品點距離的遠近,可觀察個體或群體間的差異,樣品點越相近說明樣品間微生物群落構(gòu)成越相似。在N1組內(nèi)兩點間間距較大,樣品組間有一定的差異性,而N4、N7組內(nèi)的樣品的兩點間間距極小,樣品內(nèi)部差異性較??；N1與N4、N7兩組相比較明顯分離,說明N1組與其他兩組在菌群結(jié)構(gòu)上有顯著的差異性,N4組與N7組的樣品點的距離較近,說明在發(fā)酵第7天與第14天的菌群多樣性無明顯變化,這個結(jié)果與細菌豐度圖與菌群熱圖也保持一致。

圖8 主坐標分析Fig.8 Principal coordinate analysis

2.4 呈味物質(zhì)與菌群結(jié)構(gòu)的相關(guān)性

主成分分析可直觀地將辣白菜發(fā)酵過程中主要呈味物質(zhì)與菌群結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系體現(xiàn)在二維坐標圖上,將微生物在屬水平上相對豐度前10名與主要呈味物質(zhì)進行主成分分析,結(jié)果結(jié)合圖9和表2所示,主成分1和主成分2顯示發(fā)酵過程中主要呈味物質(zhì)與菌群相對豐度前10名74.98%和7.45%的信息,前2個主成分之和大于80%,說明數(shù)據(jù)能夠代表主要呈味物質(zhì)與菌群相對豐度絕大部分信息。主要呈味物質(zhì)中的總酸含量、氨基酸氮含量、還原糖含量、乳酸含量和乙酸含量與Weissella屬[23]都呈正相關(guān),與其他菌屬呈負相關(guān),這說明Weissella屬與主要呈味物質(zhì)影響較大。Weissella屬對于食品的發(fā)酵具有促進作用[26],除了作為乳酸菌的產(chǎn)酸特性以外,還是食品風味形成的重要貢獻者,根據(jù)主成分分析來看,Weissella屬與主要呈味物質(zhì)有密切關(guān)系[25-26],通過比較傳統(tǒng)四川泡菜和韓國泡菜的微生物組成與風味發(fā)現(xiàn),四川泡菜發(fā)酵過程中不含Weissella菌,而在韓國泡菜中Weissella是優(yōu)勢乳酸菌之一；Weissella菌在提高醬油中氨基酸和有機酸含量有攝取的優(yōu)勢[27]。結(jié)合相關(guān)研究可以得出,Weissella是泡菜發(fā)酵中的優(yōu)勢菌群；Virgibacillus屬具有產(chǎn)酸的特性,它的數(shù)量變化與其他乳酸菌的數(shù)量變化能對應(yīng)發(fā)酵過程中總酸含量的變化,其他菌屬相對主要呈味物質(zhì)沒有很強的相關(guān)性。

圖9 主要呈味物質(zhì)與發(fā)酵菌群屬水平前10名主成分 分析載荷圖Fig.9 Principal component analysis load chart of the top ten main flavor substances and fermentation flora

表2 主要呈味物質(zhì)與發(fā)酵菌群屬水平前10名主成分分析相關(guān)矩陣分析Table 2 Correlation matrix analysis of principal component analysis between main flavor compounds and top ten fermentative flora

3 結(jié)論

本文主要研究辣白菜中的主要呈味物質(zhì)隨著發(fā)酵時間的增加的變化情況,利用高通量測序研究菌群結(jié)構(gòu)變化,以及主要呈味物質(zhì)與菌群結(jié)構(gòu)的關(guān)系。在發(fā)酵過程中,有機大分子被微生物分解成小分子,如還原糖和氨基酸,它們的含量都隨著發(fā)酵時間的延長而增加,與發(fā)酵過程中的微生物數(shù)量的變化趨勢基本一致。形成辣白菜風味有機酸的代表,乳酸和乙酸含量也顯著性增加。通過高通量測序技術(shù)對發(fā)酵過程中的辣白菜中的微生物多樣性進行分析,在發(fā)酵過程中微生物豐度呈下降趨勢,物種分布均勻度也降低,根據(jù)主要呈味物質(zhì)變化情況與菌群結(jié)構(gòu)相互聯(lián)系,推測其菌群結(jié)構(gòu)與風味之間的關(guān)系。根據(jù)數(shù)據(jù)分析,可以清楚的看到Weissella屬與菌落計數(shù)相距最近,同時也與總酸含量的呈味物質(zhì)呈正相關(guān),其貢獻率最好,其他菌屬呈負相關(guān),并且對主要呈味物質(zhì)貢獻率為負,說明Weissella屬對主要呈味物質(zhì)有重要作用。