曾令杰,豐丕雪,黃錦翔,安佳星,趙雪梅,龍秀鋒,伍時華,易弋

(廣西科技大學 生物與化學工程學院,廣西 柳州,545006)

隨著全球經濟的快速發(fā)展,人類對能源的需求急劇增加,傳統(tǒng)化石燃料帶來的環(huán)境污染以及能源短缺問題日益嚴重,尋找和開發(fā)利用可再生的清潔型能源來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化石燃料已成為關注焦點之一[1]。燃料乙醇是一種理想的清潔生物燃料,可以通過木質纖維素原料水解產物糖化和發(fā)酵生產。釀酒酵母因其具有生長周期短、發(fā)酵能力強等特性而被認為是生產燃料乙醇的主要微生物。但是,由于木質纖維素結構致密復雜、成分多樣,很難被酵母細胞直接利用,因此預處理是必不可少的環(huán)節(jié)。然而,預處理過程中會產生一系列木質纖維素發(fā)酵抑制物,如酚類化合物、弱酸類和呋喃類[2]。它們常常會影響酵母細胞的生長和發(fā)酵酶系的正常功能,進而降低發(fā)酵產物乙醇的產率[3-4]。酚類化合物來源于木質素的降解[5-6]、糖類物質的分解[7],雖然含量比較低,但對細胞毒害作用比有機酸和呋喃類化合物更大。其中酚醛抑制物直接影響發(fā)酵菌株的乙醇發(fā)酵,酚酸和酚醇化合物通過影響菌體生長而間接影響乙醇發(fā)酵[8]。然而,由于缺乏酚類物質準確定性定量方法,目前對酚類化合物的毒性機制研究還不夠深入。有學者推測是因為酚類物質能造成細胞膜損傷,使細胞膜的完整性喪失、選擇透過性的能力降低,從而影響酵母細胞的正常生長和發(fā)酵性能[9-10]。ZHANG等[11]研究酚類化合物可以抑制細胞內酶的活性,使酵母念珠菌SB18內木糖醇通路中有關酶失活。KEWELOH等[12]研究發(fā)現苯酚通過影響細胞膜上蛋白質和脂質含量的比例來改變細胞膜的功能。ISHIDA等[13]研究發(fā)現添加高濃度的香草醛能抑制細胞的翻譯過程,影響蛋白質的生物合成,從而抑制釀酒酵母的生長和發(fā)酵。另外,酚類化合物的毒性強弱與其分子質量大小以及取代基的位置有關。有研究指出,酚類物質對木質纖維素水解液發(fā)酵過程存在強烈的抑制[14-15],且分子質量越低的酚類化合物毒性作用越強[16-17]。因此,如何解除酚類抑制劑對水解和發(fā)酵的不利影響是木質纖維素產乙醇過程中的一個重要挑戰(zhàn)。

兒茶酚是木質纖維素水解液中常見的抑制物,但釀酒酵母應對兒茶酚的響應機制尚未闡明。本研究通過轉錄組技術分析,從mRNA水平揭示兒茶酚脅迫下釀酒酵母的響應機制,為進一步研究提高釀酒酵母酚類物質耐受性的方法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeGGSF16),由廣西科技大學微生物研究室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium,YPD)(g/L)：葡萄糖20,蛋白胨20,酵母粉10,115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖180,蛋白胨20,酵母粉10,115 ℃滅菌30 min。

1.1.3 主要試劑

兒茶酚(AR),天津市大茂化學試劑廠；RNA提取試劑盒,大連寶生物；DNA Marker,北京索萊寶科技有限公司；Tris,BioFroxx公司。

1.2 儀器與設備

DY-6D 型DNA電泳儀,北京市六一儀器廠；ZWYD—2402型搖床,上海智誠分析儀器制造有限公司；H2100R離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠；456-GC氣相色譜儀,天美創(chuàng)科儀器(北京)有限公司；高效液相色譜儀,日本株式會社日立制作所。

1.3 實驗方法

1.3.1 兒茶酚對酵母細胞發(fā)酵力的測定

挑取一環(huán)酵母細胞接種于YPD培養(yǎng)基中,30 ℃,150 r/min,搖床培養(yǎng)14 h；按10%接種量接入新鮮的YPD中培養(yǎng)至對數中期(OD600=1.109),最后按10%接種量轉接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,將兒茶酚加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中使其質量濃度為1.2 g/L,以未添加兒茶酚的菌液為對照組,30 ℃,150 r/min培養(yǎng)24 h,每隔2 h取上清液適當稀釋,用高效液相色譜儀檢測葡萄糖質量濃度,用氣相色譜儀檢測乙醇質量濃度。

1.3.2 轉錄組測序

將活化的菌種按2%接種量接種于YPD培養(yǎng)基,30 ℃,150 r/min搖床中培養(yǎng)至指數中期,將兒茶酚加入到YPD培養(yǎng)基中,使其質量濃度為1.2 g/L,并隨機分為對照組(ck1、ck2、ck3)和兒茶酚組(cat1、cat2、cat3),繼續(xù)培養(yǎng)2 h后收集細胞用于后續(xù)RNA提取。取新鮮培養(yǎng)的菌液200 μL,參照酵母RNA提取試劑盒說明書提取RNA。質量檢測合格的總RNA和mRNA用于后續(xù)建庫測序,轉錄組測序工作均在深圳華大基因科技服務有限公司完成。

1.3.3 測序數據處理及其生信分析

對測序所得到的原始數據(raw reads)首先去除含有接頭的Reads、未知堿基N含量過高、低質量的reads得到clean reads,作為本研究的基本數據。將clean reads與指定的參考基因組進行序列比對以及利用表達定量軟件RSEM對基因的表達水平進行定量分析。使用DESeq2算法對樣品之間的差異表達基因進行篩選,以P<0.05為差異值,fold change ≥2為差異倍數進行差異表達基因篩選,并進行差異基因的GO功能富集和KEGG代謝通路富集分析。

2 結果與分析

2.1 兒茶酚對酵母細胞發(fā)酵的影響

為研究兒茶酚對酵母細胞的影響,本試驗在1.2 g/L的兒茶酚培養(yǎng)條件下,測定了葡萄糖消耗及乙醇生成。由圖1可知,對照組在6～12 h葡萄糖消耗較快,18 h基本消耗完全,乙醇在6～16 h產量較多,并在18 h趨于穩(wěn)定；而在添加兒茶酚后,葡萄糖消耗延遲了4 h,即在10 h才開始消耗,乙醇生成含量明顯低于對照組,說明兒茶酚影響了酵母細胞乙醇發(fā)酵的性能,并延長了發(fā)酵周期。

圖1 兒茶酚對酵母細胞乙醇發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of catechol on ethanol fermentation of yeast cells

2.2 測序數據質控

將原始數據經過一系列數據處理來過濾雜質得到過濾數據(clean data),如表1所示。每個樣品平均產出6.85 GB的過濾數據,Q20、Q30均≥89%。用HISAT軟件將clean reads比對到參考基因組序列,如表2所示,每個樣品平均能比對到基因組中的reads數占總數的90.9%,比對上參考基因組唯一位置的clean reads比例占89.6%,說明測序結果基本達到可接受范圍,滿足后續(xù)實驗分析的需求。

表1 測序數據質量統(tǒng)計Table 1 Quality of sequencing data

表2 參考基因組比對結果Table 2 Results of reference genome alignment

2.3 測序樣品相關性分析

對照組(ck)和兒茶酚組(cat)均有3個生物學重復,共有6組轉錄組測序數據。由圖2可知處理組與對照組間相關性系數約為0.92,平行樣品間相關系數為1或接近于1,說明樣品間重復性良好,兩組間差異相對較大,結果可信度高。

圖2 樣品相關性熱圖Fig.2 Heat map of sample correlation 注：圖中右側和下側為樣本名稱,對照組(ck1、ck2、ck3)和兒茶酚組 (cat1、cat2、cat3)；左側和上側為樣本聚類情況,不同顏色的方塊 代表兩個樣本的相關性高低

2.4 差異表達基因篩選

以q<0.05以及fold change ≥2為篩選條件,對兒茶酚組(cat)和對照組(ck)差異表達基因進行檢測,如圖3所示,共篩選出223個,其中上調基因172個,下調基因52個。說明樣品間存在一定量的差異表達基因,且部分基因在差異對中表達量較大,結果也表明當釀酒酵母受到兒茶酚脅迫時,大部分基因在酵母細胞內出現了差異表達。

圖3 差異表達基因火山圖Fig.3 Volcano map of DEGs 注：Up代表上調差異表達基因,Down代表下調差異表達基因, no-DEGS非顯著差異基因

2.5 差異表達基因功能富集和信號通路分析

對篩選出進行差異表達基因進行GO富集分析,如圖4所示,橫坐標為富集比例,縱坐標為富集的GO term,氣泡的大小表示注釋到某個GO Term上的差異基因數目,顏色代表富集P值,顏色越深代表P值越小。差異表達基因主要富集在氧化還原過程、氧化還原酶活性、藥物跨膜轉運、細胞對氧化應激的反應、抗氧化活性、谷胱甘肽代謝過程、半胱氨酸的生物合成過程、葡萄糖跨膜轉運以及鐵硫團簇結合等通路。在生物體內,不同基因相互協(xié)調行使其生物學功能,為了進一步理解這些差異基因在代謝途徑里的變化情況,我們采用KOBAS在線分析工具進行了KEGG信號功能注釋,結果發(fā)現對照組(ck)與兒茶酚組(cat)共富集到67個信號通路,挑選富集最顯著的14條通路在圖形中進行展示,如圖5所示,橫坐標為富集比例,縱坐標為KEGG Pathway,氣泡的大小表示注釋到某個KEGG Pathway上的基因數目,顏色代表富集p值,顏色越深代表P值越小。這些信號通路分析主要涉及到代謝途徑、碳代謝、硫代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、ABC(ATP-binding cassette) 轉運蛋白以及磷酸戊糖途徑等多條代謝通路。以上結果表明,兒茶酚脅迫下,釀酒酵母發(fā)生了氧化應激,通過改變代謝途徑來適應脅迫壓力,并加速碳代謝,為酵母抵抗脅迫提供能量以及提高胞內抗氧化活性物質,從而抵抗兒茶酚的脅迫作用。

圖4 差異表達基因GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of DEGs

圖5 差異表達基因KEGG富集分析Fig.5 KEGG pathway analysis of DEGs

3 討論

3.1 涉及硫代謝相關的差異表達基因分析

在生物體中硫元素主要以半胱氨酸、谷胱甘肽形式存在,半胱氨酸能夠調控胞內氧化還原水平,而且還是很多酶的關鍵氨基酸,參與了眾多代謝反應[18-19]。谷胱甘肽是一類重要抗氧化物質,能夠將活性氧自由基還原,生成氧化型谷胱甘肽以發(fā)揮抗氧化功能,保護細胞內重要細胞器免受損傷[20]。在釀酒酵母中,可以通過硫代謝相關的途徑合成半胱氨酸和谷胱甘肽以發(fā)揮其生物學功能。本研究中,一些涉及硫代謝相關通路的基因出現了明顯的上調,如ssu1、sul2、met16、met14、met5、met17、cys3、gsh1、gsh2、gex1、gex2、glr1等(表3)。ssu1和sul2分別編碼亞硫酸鹽/硫酸鹽轉運蛋白,可以將胞外的硫酸鹽離子轉運入細胞內,增強了硫的吸收。有研究表明,當酵母處于硫饑餓的情況下,sul2會過量表達,如果添加合適的硫源,它們的表達量急劇下降[21]。met16、met14、met5、cys3與半胱氨酸的合成有關,其中腺苷酰硫酸激酶和亞硫酸鹽還原酶的編碼基因met14和met5分別上調了2.24倍和1.46倍。met16編碼3′-磷酸腺苷硫酸還原酶基因的表達量顯著提高了3.08倍,該酶催化3′-磷酸腺苷硫酸鹽還原為腺苷-3′,5′-二磷酸鹽和游離亞硫酸鹽,參與硫酸鹽同化和甲硫氨酸代謝。半胱氨酸合成酶A和胱硫醚γ-裂解酶的編碼基因met17和cys3的表達量分別上調了1.77和1.59倍,這2個酶都參與了半胱氨酸的合成。由此看出,釀酒酵母細胞內半胱氨酸含量的提高不僅與增強的硫吸收有關,還與上調半胱氨酸合成相關的酶有關,從而為谷胱甘肽的合成提供了充足的前體氨基酸。gsh1、gsh2、gex1、gex2這幾個基因參與了谷胱甘肽的合成,其表達量也顯著的提高。gsh1編碼γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶,該酶是谷胱甘肽合成代謝過程中的限速酶,催化谷胱甘肽生物合成的第一步,而在本實驗中,發(fā)現其表達量顯著上調2.16倍。有研究表明通過gsh1過表達使得GSH產量提高了約50%,說明gsh1表達量的提高有利于GSH的合成[22]。gsh2編碼谷胱甘肽合成酶,其表達量也上調了1.98倍,該酶催化由γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成谷胱甘肽。谷胱甘肽含量的提高不僅與關鍵前體氨基酸半胱氨酸的提高有關,還和上調的限速酶編碼基因gsh1和gsh2有關。王立梅等[23]發(fā)現釀酒酵母突變株在遭受內源性活性氧過氧化氫的脅迫下,通過調節(jié)谷胱甘肽合成限速酶活力加強了谷胱甘肽的合成。另外發(fā)現上調基因gex1、gex2、glr1,分別編碼谷胱甘肽逆轉運蛋白和谷胱甘肽還原酶,在谷胱甘肽逆轉運蛋白作用下,把谷胱甘肽轉運到活性氧較多的細胞器加速活性氧的清除,同時生成氧化型谷胱甘肽,氧化型谷胱甘肽再被谷胱甘肽還原酶(GLR1)還原成還原性谷胱甘肽繼續(xù)參與抗氧化作用。KIM等[24]研究發(fā)現過表達了谷胱甘肽合成途徑的基因gsh1和glr1,可以加強酵母細胞對糠醛的耐受能力。

3.2 涉及氧化還原相關的差異表達基因分析

通過轉錄組學的分析,發(fā)現一些參與氧化應激相關的基因表達量顯著提高(表3)。如編碼超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的基因sod1、sod2,SOD是釀酒酵母細胞內重要的抗氧化酶,其中sod1編碼含銅和鋅的超氧化物歧化酶存在細胞質中,sod2編碼含錳的超氧化物歧化酶存在線粒體中,該酶能夠催化超氧負離子和H+的反應,生成O2和H2O2。上調基因ctt1、ira1編碼的過氧化氫酶作用下,將H2O2催化為H2O,從而清除兒茶酚脅迫下氧化應激產生的活性氧。因此,猜測在兒茶酚脅迫下酵母細胞產生大量的活性氧,釀酒酵母可以合成多種酶類來清除活性氧產生的毒性。

釀酒酵母為了降低兒茶酚對細胞的毒性作用,還可以通過上調功能還原酶和大量具有NAD(P)H依賴性還原酶的活性來實現,本研究發(fā)現了一些顯著上調的基因(見表3),如ddi3、ddi2、oye3、oye2、ecm4,其中ddi3、ddi2、ecm4分別編碼氰胺水合酶、谷胱甘肽-氫醌還原酶,都顯著高表達,DDI3、DDI2對氰胺具有解毒作用,ecm4能夠依賴性地將有毒的GS-三氯對苯二酚還原為三氯對苯二酚,因此猜測這3個基因參與了釀酒酵母對兒茶酚解毒作用。oye3、oye2編碼老黃酶,研究報道這2個基因可能在甾醇代謝、氧化應激反應和細胞程序性死亡中具有潛在作用[25]。另外有研究發(fā)現老黃酶可介導釀酒酵母對丙烯醛的抗性,而丙烯醛為生物系統(tǒng)中活性氧與生物膜脂質過氧化的產物[26-27]。因此,認為oye2、oye3在本研究中介導了由活性氧引起的脂質過氧化產物的抗性,從而解除此類化合物對細胞的毒性,提高釀酒酵母在兒茶酚脅迫下的耐受性。此外,研究發(fā)現一些重要的ABC轉運蛋白基因參與了釀酒酵母在兒茶酚脅迫下的調控作用,如pdr10、pdr5、pdr18、yor1、ycf1、snq2。其中pdr10、pdr18和pdr5編碼的ABC轉運蛋白起藥物/毒素轉運和多藥物外排泵的作用,pdr10主要由Pdr1p和Pdr3p調節(jié),pdr5受Pdr1p積極調控的多藥轉運蛋白,研究表明pdr10、pdr5在細胞排毒代謝和多效性耐藥過程起著重要的作用[28]?；谝陨辖Y果,可以推測釀酒酵母通過ABC轉運蛋白家族將兒茶酚運送到胞外進行細胞排毒,從而介導釀酒酵母對兒茶酚的耐受性。

3.3 涉及碳代謝相關的差異表達基因分析

釀酒酵母應對兒茶酚的脅迫,消耗輔因子NAD(P)H和ATP導致氧化還原不平衡,從而使細胞代謝損傷,面對這樣的問題,釀酒酵母選擇了改變代謝途徑來適應脅迫壓力。一些相關的基因表達水平發(fā)生了變化(表3),如zwf1、gnd1、gnd2、tdh1、err1、err3以及編碼鐵硫簇相關的基因nbp35、dre2、tah18、nar1、nfs1、isu2。其中zwf1編碼的6-磷酸葡萄糖脫氫酶,戊糖磷酸途徑的第一步反應,催化葡萄糖-6-磷酸生成磷酸葡萄糖酸-δ-內脂,是酵母細胞中NADPH產生的主要途徑之一,參與適應氧化應激反應。而gnd1和gnd2編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶,該酶催化磷酸葡萄糖酸生成核酮糖-5-磷酸,在戊糖磷酸途徑中催化NADPH再生反應。這2個限速酶通過磷酸戊糖途徑產生大量的NADPH,為細胞的各種合成反應提供還原力,維持了細胞內氧化還原水平。編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶基因tdh1表達量上調了3.58倍,該酶主要參與糖酵解中催化3-磷酸甘油醛氧化成1,3-二磷酸甘油酸生成NADH。err1、err3編碼烯醇化酶,一種磷酸丙酮酸水合酶,催化2-磷酸甘油酸生成磷酸烯醇式丙酮酸,加速了磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的轉化生成ATP。nbp35和isu2是鐵硫蛋白合成所需的線粒體蛋白,參與線粒體和胞質蛋白的Fe-S簇組裝。nfs1編碼半胱氨酸脫硫酶,在鐵硫簇組裝中提供硫原子。nar1為胞質鐵硫蛋白組裝的亞基,ZHAO等[29]報道,nar1缺失導致細胞壽命縮短和對百草枯的敏感性提高,對氧化應激具有保護作用。

表3 兒茶酚脅迫下釀酒酵母應答的相關基因Table 3 Related genes of S.cerevisiae response to catechol stress

tah18編碼NADPH依賴的二黃素氧化還原酶Ⅰ,它們參與了黃素轉運蛋白和生物合成,直接參與氧化還原過程,該過程將電子轉移到線粒體的電子傳輸鏈中并和Fe-S簇組裝蛋白(DRE2)之間的相互作用,對于調節(jié)氧化應激誘導的細胞死亡和胞質中Fe-S蛋白的合成至關重要,且DRE2-TAH18復合物可以防止H2O2誘導的細胞死亡[30]。由此可知,釀酒酵母在兒茶酚脅迫下,通過改變代謝途徑以及上調鐵硫蛋白合成相關的基因,在氧化應激反應中維持細胞內氧化還原水平和充足的能量發(fā)揮著重要的作用,從而提高了酵母細胞對兒茶酚的抵抗能力。

4 結論

釀酒酵母對木質纖維素水解液抑制劑兒茶酚的適應性和耐受性存在復雜的基因相互作用、調控網絡和協(xié)同調控。本研究在轉錄組水平上研究了釀酒酵母潛在的兒茶酚應激反應機制。兒茶酚脅迫下可引起釀酒酵母氧化性損傷,影響細胞內相關酶活性,從而影響細胞的正常生長。釀酒酵母通過提高硫代謝途徑來響應兒茶酚的脅迫,加強了半胱氨酸和谷胱甘肽的合成,在抗氧化、清除活性氧方面有著重要的作用；其次,通過上調涉及氧化還原相關功能酶的基因表達來響應兒茶酚脅迫,從而清除酵母細胞內過多的ROS,并在多種ABC轉運蛋白作用下對釀酒酵母細胞排毒；最后,通過加速碳代謝,為酵母抵抗脅迫提供能量以及維持細胞內NAD(P)H水平,在酵母的適應和能量再平衡中發(fā)揮作用,使酵母能夠生存和適應兒茶酚脅迫。通過本研究探討釀酒酵母兒茶酚脅迫響應機制,為進一步研究提高釀酒酵母酚類物質耐受性的方法提供理論指導意義。