陳宇錕,黎青華,周景文,張國強*,李江華

1(糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

α-淀粉酶 (EC 3.2.1.1) 是一類重要的工業(yè)酶,它可以催化水解淀粉等碳水化合物分子內部的α-D-(1,4)-糖苷鍵,廣泛應用于淀粉糖化、烘焙、紡織等行業(yè)[1-2]。目前,α-淀粉酶仍存在發(fā)酵酶活力低或耐酸、耐熱性不足等問題,并不能完全滿足工業(yè)需求[3]。地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis) 是產α-淀粉酶的重要宿主,具有耐熱,蛋白分泌能力強等特點,在淀粉酶發(fā)酵工業(yè)中具有廣泛應用[4]。同時,地衣芽孢桿菌作為一種很有潛力的底盤細胞,在代謝工程、酶工程等領域也備受關注,實現(xiàn)了不同酶的高效表達。然而,關于地衣芽孢桿菌遺傳操作系統(tǒng)雖然已有報道[5-10],但是現(xiàn)階段的遺傳操作方法仍存在效率低及不穩(wěn)定等問題。

近年來,基于自動化和儀器分析技術的高通量篩選平臺突破了人工篩選在效率、穩(wěn)定性和標準化等方面的限制,成為菌種選育與工業(yè)酶改造篩選的重要方法。其中,液滴微流控是一種將反應體系微型化的技術,被應用于生物醫(yī)學以及微生物、酶的高通量篩選[11-16]。該技術可以實現(xiàn)在微體積、大小均一的液滴中對單細胞進行培養(yǎng)、反應、檢測和篩選,具有篩選成本低、效率高 (106/h) 等優(yōu)勢[17]。AGRESTI等[18]利用液滴微流控體系對辣根過氧化物酶進行定向進化,通過對107個酵母細胞表面展示的突變體篩選,10 h內成功將酶活性提高10倍。HUANG等[19]利用液滴微流控系統(tǒng)篩選誘變處理的α-淀粉酶分泌酵母菌株,對篩選到的高淀粉酶分泌菌株全基因組測序,并解析其分泌機制。

本研究基于實驗室前期篩選獲得的產α-淀粉酶地衣芽孢桿菌BLH菌株及其突變體庫,通過單細胞液滴制備、液滴反應時間與篩選電壓等條件優(yōu)化,建立了高效的產α-淀粉酶地衣芽孢桿菌液滴微流控篩選方法,最終獲得5株高產α-淀粉酶突變菌株。本研究利用高通量篩選方法實現(xiàn)了高產淀粉酶地衣芽孢桿菌的高效進化篩選,也為其他高性能蛋白表達分泌宿主的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種及培養(yǎng)基

本研究所用的產α-淀粉酶地衣芽孢桿菌BLH及其突變體庫為實驗室保藏菌株；LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5,胰蛋白胨10,NaCl 10,固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉34；TB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉24,胰蛋白胨12,磷酸氫二鉀12.54,磷酸二氫鉀2.31,甘油5。

1.1.2 主要實驗材料

DQ淀粉底物 (BODIPY熒光素偶聯(lián)淀粉),賽默飛;2% Pico-Surf in Novec 7500/FC40,Dolomite;Droplet Generation Oil for EvaGreen,Bio-Rad;可溶性淀粉及其他化學試劑,國藥集團。

二硝基水楊酸 (dinitrosalicylic acid,DNS) 還原糖測定試劑：稱取6.3 g DNS并量取262 mL 2 mol/L NaOH加到酒石酸鉀鈉的熱溶液中 (182 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL去離子水中),再加入5 g結晶酚和5 g亞硫酸氫鈉,攪拌溶解,冷卻后定容至1 000 mL,貯存于棕色瓶中,放置7 d后使用。

緩沖液 (pH=6.0)：稱取45.23 g Na2HPO4·12H2O和8.07 g一水合檸檬酸,用去離子水溶解并定容至1 000 mL,用pH計校正后使用。

1.1.3 主要儀器與設備

本研究用到的液滴微流控平臺包括液滴生成系統(tǒng)、光路系統(tǒng)和分選系統(tǒng)等部分。其中,微液滴生成系統(tǒng)包括液滴生成芯片及微量注射泵,光路系統(tǒng)包括激光器及熒光數(shù)據(jù)采集器,篩選系統(tǒng)包括高壓放大器及液滴微流控分選芯片[20]。

1.2 實驗方法

1.2.1 α-淀粉酶熒光檢測方法

將DQ淀粉配制成質量濃度為200 μg/mL的溶液,取標準α-淀粉酶溶液稀釋至不同濃度,分別取50 μL DQ淀粉溶液和50 μL不同濃度的α-淀粉酶溶液加入到熒光檢測專用酶標板中,測定不同時間的熒光值 (Ex=488 nm/Em=520 nm),以驗證熒光強度與酶活力及反應時間的相關性關系。

1.2.2 單細胞制備方法

將出發(fā)菌株單菌落或突變體庫接種于3 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃ 250 r/min培養(yǎng)10～12 h至OD600=2.0左右。此時菌體處于指數(shù)生長期,為菌絲狀態(tài),無法用于單細胞液滴包埋。因此,將菌液超聲處理1～4 min (950 W,2%,超聲5 s,停5 s),并在顯微鏡下觀察單細胞分散效果,選擇細胞分散效果最好且菌體破碎較少的處理時間進行實驗,再用5 μm濾膜除去大顆粒及未徹底分散的菌絲,制備獲得單細胞。

1.2.3 單細胞液滴包埋方法

用LB培養(yǎng)基清洗突變體庫單細胞菌體3遍,并將OD600值調整至0.07,利用液滴生成芯片制備單細胞液滴。水相為含突變體菌體的LB培養(yǎng)基懸液,其中含有終質量濃度為100 μg/mL的DQ淀粉,總體積400 μL；油相為2% Pico-Surf in FC40、2% Pico-Surf in Novec 7500或者Bio-Rad液滴生成油。將油相和水相分別吸到1 mL無菌注射器內,注射器安裝到微量注射泵中并用導管與芯片連接,設定油相流速為400 μL/h,水相流速為200 μL/h,生成直徑約為20 μm的單細胞液滴,用裝有200 μL對應油相的1 mL無菌注射器收集液滴。將裝有單細胞液滴的注射器放置在37 ℃下避光靜置培養(yǎng),定時取樣觀察液滴,評價液滴穩(wěn)定性,選擇液滴最穩(wěn)定的油相進行后續(xù)實驗。

1.2.4 突變體庫的液滴微流控篩選

將收集到的單細胞液滴放置在37 ℃下靜置培養(yǎng),定時取樣觀察液滴中的熒光變化情況,選擇適宜的培養(yǎng)時間進行液滴微流控篩選。篩選時將裝有油相和液滴的注射器安裝到微量注射泵中,用導管將注射器出口連接到微流控液滴分選芯片對應的入口,設置油相流速為200 μL/h、液滴流速為10～15 μL/h,此時液滴流速約為500～1 000個/s。將藍色激光 (488 nm) 對準篩選芯片的檢測點,并采集每個液滴的綠色熒光信號 (520 nm),針對熒光強度最高的30%左右的液滴進行加電,電壓設置為300 或500 V,使這些液滴流向篩選芯片的液滴收集出口,將收集到的液滴涂布到LB平板上。

1.2.5 篩選后菌株搖瓶發(fā)酵

從平板上挑取若干經液滴微流控篩選出的單菌落接種到2 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃ 250 r/min培養(yǎng)12 h作為種子液,同時接種出發(fā)菌株作為對照。初篩時將種子液按1%的接種量轉接到裝有10 mL TB培養(yǎng)基的100 mL搖瓶中,復篩時按起始OD600=0.05進行轉接,37 ℃ 250 r/min培養(yǎng)72 h。測定發(fā)酵液OD600值,并用DNS法測定上清液中的α-淀粉酶活性。

1.2.6 酶活力測定方法

用DNS法[21]測定發(fā)酵液上清液中的α-淀粉酶活性,具體方法如下：將可溶性淀粉加去離子水煮沸至完全透明,配制成2%的溶液作為酶反應底物,取300 μL底物和100 μL pH=6.0緩沖液到試管中,70 ℃預熱2 min,再加入100 μL適當稀釋的發(fā)酵上清液,70 ℃準確反應5 min后,加入500 μL DNS試劑終止反應,沸水浴10 min,冰上冷卻至室溫后,將顯色后的反應液用去離子水稀釋4倍并測定540 nm下的吸光值,以滅活酶為對照,根據(jù)葡萄糖制作的標準曲線計算體系中的還原糖量 (以葡萄糖計),計算發(fā)酵液上清液中的α-淀粉酶活性,1 U酶活力定義為：1 min降解可溶性淀粉生成1 mg葡萄糖當量的還原性糖的酶量。

2 結果與分析

2.1 α-淀粉酶熒光檢測方法的建立與優(yōu)化

本研究中所用DQ淀粉底物骨架上嵌合有BODIPY熒光素,初始狀態(tài)下熒光素處于淀粉顆粒內部,無法被激發(fā)產生熒光。當?shù)矸郾坏矸勖杆鈺r,淀粉鏈打開,其中的熒光素暴露出來,能被激發(fā)產生熒光,而淀粉水解速度與酶活性具有相關性,所以可以通過熒光強度檢測酶活力高低[22]。為建立DQ淀粉底物熒光強度與酶活力的相關性曲線,將不同酶活力的α-淀粉酶溶液與DQ淀粉底物溶液混合進行反應,并測定不同反應時間的熒光值。結果顯示,α-淀粉酶能有效降解DQ淀粉并產生熒光,且反應靈敏度高,微量酶活力 (>0.001 U/mL) 條件下,30 min即能產生明顯熒光差異 (圖1)。在一定酶活力范圍內(<0.008 U/mL),熒光強度與酶活呈線性關系 (R2>0.97),同時也與反應時間呈正相關 (R2>0.96),能完全滿足檢測液滴內單細胞產生的α-淀粉酶活性的要求。

圖1 基于DQ淀粉底物的熒光檢測方法的優(yōu)化Fig.1 Optimization of fluorescence test based on DQ starch substrate

2.2 高活性單細胞制備

地衣芽孢桿菌在指數(shù)生長期以菌絲狀態(tài)存在 (圖2-a),無法直接用于單細胞液滴包埋和篩選。雖然培養(yǎng)至穩(wěn)定期菌絲會斷裂成單細胞,但是實驗中發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定期的地衣芽孢桿菌單細胞無法在液滴中產酶,甚至無法生長,推測是由于穩(wěn)定期的菌體活性較低導致,無法適用于進一步的液滴包埋、培養(yǎng)和分選等環(huán)節(jié)。因此,為獲得能用于單細胞液滴包埋和篩選所需要的高活性地衣芽孢桿菌單細胞,本研究選取指數(shù)生長期的菌絲進行超聲處理 (950 W，2%,超聲5 s,停5 s) 獲得單細胞菌液[23],再經5 μm濾膜過濾去除剩余菌絲及細胞團等顆粒[24]。超聲處理2 min后,大部分菌絲斷裂成單細胞,雖然仍有部分菌絲,但經過濾處理后,菌液中均為單細胞 (圖2-b)。后續(xù)實驗也證明超聲波處理后的單細胞具有較好活力,可以在液滴中有效產α-淀粉酶并用于后續(xù)的液滴篩選。

a-指數(shù)生長期的地衣芽孢桿菌；b-超聲波處理并過濾后的地衣芽孢桿菌圖2 超聲波處理地衣芽孢桿菌菌絲制備高活性單細胞Fig.2 Ultrasonic treatment of cell chains for high performance single cells of B.licheniformis

2.3 單細胞液滴包埋條件優(yōu)化

液滴穩(wěn)定性是液滴微流控技術的關鍵影響因素[11],已有報道表明水相和油相性質等對液滴的穩(wěn)定性影響較大[25]。為評價不同油相對產α-淀粉酶地衣芽孢桿菌微液滴包埋的影響并選出合適的油相,本研究分別選用2% Pico-Surf in FC40、2% Pico-Surf in Novec 7500和Bio-Rad液滴生成油進行單細胞液滴包埋并評價其穩(wěn)定性。其中2% Pico-Surf in FC40黏度較大,無法在芯片中生成液滴。2% Pico-Surf in Novec 7500和Bio-Rad液滴生成油均能生成直徑20 μm左右的均一液滴,將兩者放置在37 ℃下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)6 h后,分別取樣觀察液滴,發(fā)現(xiàn)2% Pico-Surf in Novec 7500生成的液滴較穩(wěn)定 (圖3-a),所有液滴直徑均保持在20 μm左右；而Bio-Rad液滴生成油生成的液滴出現(xiàn)部分較大的液滴 (圖3-b),約10%的液滴直徑達到了30～40 μm,說明部分液滴發(fā)生了破碎和融合,因此本研究選用2% Pico-Surf in Novec 7500進行單細胞液滴包埋。

a-2% Pico-Surf in Novec 7500生成的單細胞液滴； b-Bio-Rad液滴生成油生成的單細胞液滴圖3 不同油相對單細胞液滴穩(wěn)定性的影響Fig.3 The stability of single cell droplets in different oil phase

2.4 突變體庫的液滴微流控篩選

將突變體庫單細胞液滴放置在37 ℃下靜置避光培養(yǎng),定時取樣觀察熒光,以確定合適的液滴分選時間。結果表明：液滴培養(yǎng)2 h,液滴中出現(xiàn)較弱的熒光；繼續(xù)培養(yǎng)至3 h,液滴熒光增強,達到液滴微流控篩選的分選范圍。此時,部分液滴熒光較強,另一部分液滴熒光較弱,說明液滴中的單細胞產出的α-淀粉酶活性有差異 (圖4)。

圖4 不同培養(yǎng)時間對單細胞液滴熒光的影響Fig.4 Effect of culture time for fluorescence intensity in single cell droplets

由于不同批次液滴的熒光強度分布具有差異,液滴分選時需要根據(jù)實際熒光信號分布進行篩選閾值的優(yōu)化,對高于篩選閾值的液滴進行適當加電篩選 (圖5),備選電壓有300和500 V。實驗結果表明,使用500 V進行篩選時,液滴內的細胞存活率降低,大部分情況平板上無菌落長出；篩選電壓降到300 V時,細胞存活率提高至15%左右,菌落數(shù)足夠用于后續(xù)的搖瓶發(fā)酵驗證。根據(jù)以上單細胞液滴培養(yǎng)時間和篩選參數(shù)的優(yōu)化,將單細胞液滴在37 ℃下靜置避光培養(yǎng)3 h后進行液滴篩選,篩選時將電壓設置為300 V,同時設置合適的閾值以篩選出熒光強度最高的3‰左右的液滴,將篩選出的液滴涂布到LB平板上。

圖5 液滴篩選閾值設置Fig.5 Threshold setup for droplet sorting

2.5 菌株的搖瓶發(fā)酵評價

待平板上長出菌落,隨機挑取81個單菌落進行搖瓶發(fā)酵初篩。從結果可以看出,與出發(fā)菌株BLH相比,除個別菌株酶活力降低外,其他菌株酶活力均有不同程度的提高,其中最高酶活力為969 U/mL,提高了63% (圖6-a)。通過對發(fā)酵酶活力降低的菌株分析發(fā)現(xiàn),發(fā)酵酶活力的降低主要由單位細胞產酶能力降低或者菌體生長能力不足造成。因此,生產菌株需要在菌體生長和單位細胞產酶能力之間達到一個最佳的平衡點才能使得總產酶量最大化。

a-搖瓶初步評價酶活分布；b-高產菌株搖瓶驗證圖6 篩選菌株酶活評價及高產菌株搖瓶驗證Fig.6 α-amylase activity distribution and reassessment of several best strains

選擇初篩發(fā)酵酶活力最高的5株菌進行搖瓶發(fā)酵復篩驗證。結果顯示,這5株菌的發(fā)酵酶活力分別為：817、832、847、802和900 U/mL,較出發(fā)菌株BLH (541 U/mL) 分別提高了51%、54%、57%、48%和66%,單位細胞酶活力較BLH分別提高了23%、25%、42%、76%和43% (圖6-b)。可以看出發(fā)酵酶活力提升的比例與單位細胞酶活力提升的比例并不完全一致,發(fā)酵酶活力最高的菌株的菌體濃度和單位細胞酶活力均處于中間偏高的位置,這也進一步說明菌體生長和單位細胞產酶能力需要一定的平衡才能達到最優(yōu)的產酶效率。

3 結論

地衣芽孢桿菌作為產α-淀粉酶的重要工業(yè)微生物,廣泛應用于食品、紡織等行業(yè)。針對地衣芽孢桿菌的微生物育種研究也越來越多,但缺乏適用于地衣芽孢桿菌的高通量篩選方法成為目前主要的障礙。本研究以產α-淀粉酶地衣芽孢桿菌為例,通過超聲處理將指數(shù)生長期的地衣芽孢桿菌菌絲制備成高活性的單細胞,并選用2% Pico-Surf in Novec 7500作為油相包埋獲得穩(wěn)定的單細胞液滴,最后優(yōu)化了培養(yǎng)時間和篩選電壓分別為3 h和300 V,構建基于液滴微流控的高通量篩選方法,并成功從地衣芽孢桿菌BLH的突變體庫中篩選出了5株α-淀粉酶產量有效提高的突變體,發(fā)酵酶活力最高提高66%。

為進一步解析菌株高產α-淀粉酶的機制,我們將從高產菌株的基因組中挖掘分析突變位點,從中找出提高酶的表達和分泌量的關鍵突變位點,為提高地衣芽孢桿菌中的分泌表達效率提供指導。此外,在實驗過程中,我們發(fā)現(xiàn)液滴微流控篩選時的電壓對菌體的存活率影響較大。針對這一點,可以繼續(xù)優(yōu)化水相和油相的成分,并對篩選芯片通道進行改進,達到在更低電壓下實現(xiàn)目標液滴偏轉的效果,提高篩選菌株存活率。隨著人工智能等領域的快速發(fā)展,液滴微流控設備不斷成熟,硬件條件基本能滿足大部分微生物的包埋、培養(yǎng)等。因此,如何針對不同目標底物或產物開發(fā)特異性篩選方法將成為構建液滴微流控等高通量篩選方法的關鍵,也將進一步擴大其在工業(yè)生物技術中的應用[26]。