程錦生

（上海東富龍醫(yī)療裝備有限公司，上海 201108）

關(guān)鍵字：細(xì)胞藥品化；蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)；合規(guī)性；成本控制；規(guī)?；?/p>

細(xì)胞治療即來源于人自體或異體的體細(xì)胞，經(jīng)體外操作后回輸（或植入）人體的治療方法[1]。細(xì)胞治療產(chǎn)品是指人源的活細(xì)胞產(chǎn)品，包括由細(xì)胞系，以及來源于自體或異體的免疫細(xì)胞、干細(xì)胞和組織細(xì)胞等生產(chǎn)的產(chǎn)品[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前全球有超過1 000項(xiàng)已獲批或正在研究的細(xì)胞療法，其中占比最大的當(dāng)屬免疫細(xì)胞治療中的嵌合受體抗原T細(xì)胞（CAR-T）以及干細(xì)胞療法中的間充質(zhì)干細(xì)胞MSC細(xì)胞治療產(chǎn)品，是細(xì)胞治療的典型代表。我國2020年CDE共受理了25個(gè)細(xì)胞治療產(chǎn)品的IND申請(qǐng)，其中CAR-T類產(chǎn)品為14個(gè)，間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品5個(gè)，占據(jù)細(xì)胞治療產(chǎn)品的絕大多數(shù)。雖然國內(nèi)暫無上市的細(xì)胞治療產(chǎn)品，中國的細(xì)胞治療產(chǎn)品距離上市越來越近，在2021年有望出現(xiàn)第一個(gè)批準(zhǔn)上市的CAR-T產(chǎn)品。

細(xì)胞治療及細(xì)胞技術(shù)產(chǎn)品的創(chuàng)新發(fā)展，對(duì)監(jiān)管法規(guī)提出了巨大挑戰(zhàn)。對(duì)于細(xì)胞治療產(chǎn)品監(jiān)管政策，我國在不斷摸索中逐漸建立完善，2009年國家衛(wèi)生部首次將部分免疫細(xì)胞治療納入第三類醫(yī)療技術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)入管理，2017年12月22日，原國家食藥監(jiān)總局發(fā)布《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，法規(guī)指出：“細(xì)胞治療產(chǎn)品可按照藥品管理相關(guān)法規(guī)進(jìn)行研發(fā)和注冊(cè)申報(bào)”，并在藥學(xué)研究、非臨床研究、臨床研究等方面進(jìn)行了細(xì)化的規(guī)范指導(dǎo)[3]，該法規(guī)標(biāo)志著我國正式開啟細(xì)胞治療產(chǎn)品的注冊(cè)上市流程。2018年2月9日藥品評(píng)審中心組織召開了“CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品申報(bào)臨床試驗(yàn)藥學(xué)研究和申報(bào)資料基本要求”研討會(huì)，形成了《細(xì)胞治療產(chǎn)品申請(qǐng)臨床試驗(yàn)藥學(xué)研究和申報(bào)資料的考慮要點(diǎn)》，該文件對(duì)生產(chǎn)原料、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量及穩(wěn)定性研究等要點(diǎn)進(jìn)行闡述，為同類藥品的研發(fā)和申報(bào)資料準(zhǔn)備提供參考[4]。在此之后，又相繼出臺(tái)了一系列法規(guī)，對(duì)細(xì)胞治療的藥品管理法規(guī)進(jìn)行進(jìn)一步完善，基本實(shí)現(xiàn)細(xì)胞治療產(chǎn)品從醫(yī)療技術(shù)向藥品的轉(zhuǎn)化，奠定了細(xì)胞治療藥品化的基礎(chǔ)。

細(xì)胞治療產(chǎn)品藥品化生產(chǎn)標(biāo)志著細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)方式的巨大轉(zhuǎn)變，細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)與質(zhì)量控制體系需要根據(jù)GMP藥品法規(guī)進(jìn)行改革，針對(duì)生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵因素，人、機(jī)、物、法、料、環(huán)的管控以及各個(gè)制備生產(chǎn)階段，都需要按照GMP法規(guī)進(jìn)行適應(yīng)性變化，因此，細(xì)胞治療產(chǎn)品藥品化生產(chǎn)是對(duì)細(xì)胞治療產(chǎn)品的系統(tǒng)性挑戰(zhàn)，是細(xì)胞生產(chǎn)作業(yè)方式的全面、系統(tǒng)、規(guī)范化的升級(jí)改革。如何確保GMP合規(guī)性并同時(shí)滿足成本控制及規(guī)?；笫敲總€(gè)細(xì)胞治療機(jī)構(gòu)面臨的共同問題。尤其在儀器設(shè)備方面，細(xì)胞治療藥品化生產(chǎn)的GMP法規(guī)挑戰(zhàn)尤其嚴(yán)峻，傳統(tǒng)化細(xì)胞生產(chǎn)設(shè)備目前已滿足不了GMP法規(guī)、規(guī)模化及成本控制要求，尤其在細(xì)胞培養(yǎng)上，傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備功能設(shè)計(jì)未考慮GMP法規(guī)要求，安全性及數(shù)據(jù)追溯存在不足，多數(shù)設(shè)備僅供研究使用，而且不符合成本控制及規(guī)?；a(chǎn)要求，亟待革新。蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)經(jīng)過我們長期測試研發(fā)，在充分考慮GMP合規(guī)性的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)關(guān)注成本控制及生產(chǎn)效率提高，配合自主GMP全站系統(tǒng)設(shè)備使用，是細(xì)胞藥品化及規(guī)?；a(chǎn)的有效解決方案。

1 蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)及其優(yōu)勢

蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)即集成獨(dú)立密閉可擴(kuò)展培養(yǎng)箱功能單元、GMP符合性上層控制及完整數(shù)據(jù)追溯系統(tǒng)及蜂巢式主體結(jié)構(gòu)框架于一體的細(xì)胞治療產(chǎn)品細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)系統(tǒng)設(shè)備，在滿足醫(yī)用二氧化碳培養(yǎng)箱法規(guī)對(duì)工作環(huán)境、外觀及結(jié)構(gòu)、氣體濃度及溫濕度控制等要求的基礎(chǔ)上[5-6]，可實(shí)現(xiàn)不同類型/批次細(xì)胞治療產(chǎn)品物在同一系統(tǒng)設(shè)備下同時(shí)相互隔離培養(yǎng)，在密閉隔離條件下提供細(xì)胞培養(yǎng)所需環(huán)境條件同時(shí)，滿足GMP對(duì)軟件系統(tǒng)控制及數(shù)據(jù)管理及追溯的要求。該系統(tǒng)主要分為電氣控制系統(tǒng)、RTP（無菌快速對(duì)接）培養(yǎng)箱及蜂巢式主體結(jié)構(gòu)框架三個(gè)部分，如圖1所示。

圖1 蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)示意Fig.1 Beehive Incubator management system

1.1 電氣控制系統(tǒng)

蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)的電氣控制系統(tǒng)集電氣控制與數(shù)據(jù)管理為一體，系統(tǒng)通過主控制計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)對(duì)每一個(gè)RTP培養(yǎng)箱模塊實(shí)現(xiàn)獨(dú)立平行控制，提供細(xì)胞培養(yǎng)所需溫度、氣體及濕度環(huán)境。數(shù)據(jù)管理方面，系統(tǒng)具備三級(jí)權(quán)限設(shè)置及掃碼識(shí)別功能，可以生產(chǎn)批次為單位記錄所有相關(guān)操作信息并以工作日志體現(xiàn)，滿足FDA電子記錄和電子簽名相關(guān)要求。電氣控制系統(tǒng)與RTP培養(yǎng)箱之間采用無線通訊（WIFI）技術(shù)實(shí)現(xiàn)信號(hào)連接，實(shí)時(shí)監(jiān)控追蹤檢測培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵培養(yǎng)技術(shù)參數(shù)，并在異常出現(xiàn)時(shí)及時(shí)預(yù)警，提醒人工干預(yù)，所有培養(yǎng)參數(shù)可按照指定取樣間隔進(jìn)行自動(dòng)化整理歸納，形成連續(xù)式批培養(yǎng)生產(chǎn)記錄。

1.2 RTP（無菌快速對(duì)接）培養(yǎng)箱

蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)的RTP培養(yǎng)箱模塊，每個(gè)模塊都是獨(dú)立的培養(yǎng)控制單元，RTP培養(yǎng)箱是密閉的培養(yǎng)系統(tǒng)，氣體進(jìn)出均采用0.22微米空氣過濾器，使之與其他RTP培養(yǎng)箱模塊實(shí)現(xiàn)空間上的完全隔離，可以實(shí)現(xiàn)多批次同時(shí)培養(yǎng)。RTP培養(yǎng)箱采用航天對(duì)接器的原理，將RTP（快速轉(zhuǎn)運(yùn)接口）應(yīng)用到培養(yǎng)箱上，可在密閉條件下與多設(shè)備實(shí)現(xiàn)無菌密閉式對(duì)接，在密閉無菌的環(huán)境下完成相應(yīng)工藝工序。RTP培養(yǎng)箱系統(tǒng)采用過氧化氫滅菌，滅菌效果能達(dá)到6 log，在批次培養(yǎng)轉(zhuǎn)換時(shí)，可以對(duì)RTP培養(yǎng)箱腔體內(nèi)部進(jìn)行徹底滅菌。

1.3 蜂巢式主體框架結(jié)構(gòu)

以類似蜂巢式的排列方式對(duì)RTP培養(yǎng)箱模塊進(jìn)行組合排列，有效利用空間，提高空間利用率。

比較傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)箱，蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)在細(xì)胞治療產(chǎn)品藥品化生產(chǎn)應(yīng)用上具備諸多優(yōu)勢，首先體現(xiàn)在GMP合規(guī)性上，蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)是可自動(dòng)化滅菌的密閉式培養(yǎng)設(shè)備，可有效減少污染和交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)配功能完備的電氣控制系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)培養(yǎng)過程的全程監(jiān)控與控制，生成可供追溯的記錄。其次是成本控制及生產(chǎn)效率，蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)屬于密閉培養(yǎng)設(shè)備，根據(jù)《GMP附錄-細(xì)胞治療產(chǎn)品》法規(guī)要求，蜂巢培養(yǎng)箱的背景環(huán)境可以為D級(jí)潔凈環(huán)境并且滿足多批次同時(shí)培養(yǎng)要求，再者蜂巢培養(yǎng)箱系統(tǒng)的蜂巢式結(jié)構(gòu)可有效提高空間利用率，因此可以大幅減少廠房投入并提高生產(chǎn)效率。

2 蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)在細(xì)胞藥品化生產(chǎn)中的應(yīng)用

蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)功能滿足多種細(xì)胞治療產(chǎn)品的藥品化生產(chǎn)工藝要求，包含但不限于各種免疫細(xì)胞及干細(xì)胞產(chǎn)品。為了驗(yàn)證蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)在細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用效果，依托東富龍生物技術(shù)模擬驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室，以傳統(tǒng)培養(yǎng)箱為對(duì)照組，選擇細(xì)胞治療產(chǎn)品的代表性培養(yǎng)生產(chǎn)工藝對(duì)蜂巢培養(yǎng)箱功能進(jìn)行驗(yàn)證測試，驗(yàn)證測試D級(jí)環(huán)境背景下蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)效果以及無菌性保證，進(jìn)而確認(rèn)其是否能夠滿足細(xì)胞藥物制備生產(chǎn)規(guī)范及工藝的要求。

2.1 人外周血來源的T淋巴細(xì)胞制備測試驗(yàn)證

2.1.1 驗(yàn)證方案

按照T淋巴細(xì)胞制備標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)規(guī)程進(jìn)行T擴(kuò)增放大培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞總數(shù)達(dá)到2×109以上時(shí)，按1×106mL接種至10個(gè)225 T的培養(yǎng)瓶，平均分為2組，每組5個(gè)樣本，標(biāo)注蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)及傳統(tǒng)培養(yǎng)箱組并編號(hào)后，分別置于后分別置于傳統(tǒng)培養(yǎng)箱、蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，每天取樣檢測記錄細(xì)胞數(shù)，每3 d按照1×106進(jìn)行擴(kuò)增，培養(yǎng)完成后進(jìn)行內(nèi)毒素及無菌檢測測試，并對(duì)比最終細(xì)胞收獲量及細(xì)胞生長過程曲線。

2.1.2 驗(yàn)證結(jié)果

2.1.2.1 T細(xì)胞生長記錄

表1 T細(xì)胞生長記錄（數(shù)據(jù)來自驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室）Tab.1 T cell expension daily test records

圖2 T細(xì)胞生長曲線對(duì)比（數(shù)據(jù)來自驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室）Fig.2 T cell expension profile

2.1.2.2 內(nèi)毒素及無菌檢測，見表2。

表2 T細(xì)胞內(nèi)毒素及無菌檢測記錄（數(shù)據(jù)來自驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室）Tab.2 T cell endotoxin and sterility test records

2.1.2.3 驗(yàn)證結(jié)論

蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)組與傳統(tǒng)培養(yǎng)箱組培養(yǎng)組T細(xì)胞的擴(kuò)增生長曲線基本一致，從生長曲線上看，第6天開始，蜂巢培養(yǎng)箱組的細(xì)胞擴(kuò)增生長速度占據(jù)一定優(yōu)勢。經(jīng)過11 d的培養(yǎng)后，T淋巴細(xì)胞的活細(xì)胞總數(shù)（TNC）分別為（29.16±2.24）×109與（31.50±0.99）×109，P= 0.080（P＞0.05）。蜂巢培養(yǎng)箱組獲得的T細(xì)胞活細(xì)胞總數(shù)（TNC）高于傳統(tǒng)培養(yǎng)箱，但兩者無顯著差異（P＞0.05）。內(nèi)毒素及無菌檢測結(jié)果均為陰性，蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)能夠有效提供無菌保障。

結(jié)論：D級(jí)環(huán)境背景下蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)可以根據(jù)需要提供適宜的T生長環(huán)境及無菌性保證，滿足以T細(xì)胞治療產(chǎn)品制備生產(chǎn)工藝要求。

2.2 人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)測試驗(yàn)證

2.2.1 驗(yàn)證方案

凍存的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）P3代種子細(xì)胞，按照臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制備標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)規(guī)程處理，P3代種子細(xì)胞解凍復(fù)蘇后按4 000 cm2的密度接種至10個(gè)175 T的培養(yǎng)瓶中，平均分為2組，每組5個(gè)樣本，標(biāo)注蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)組及傳統(tǒng)培養(yǎng)箱組并編號(hào)后，分別置于傳統(tǒng)培養(yǎng)箱、蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，第3天觀察拍照記錄并換液，第6天觀察并進(jìn)行消化收集，計(jì)算細(xì)胞收獲量，之后按4 000 cm2接種繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)毒素及無菌檢測測試，并對(duì)比最終細(xì)胞收獲量、細(xì)胞生長情況及二倍增長時(shí)間。

2.2.2 驗(yàn)證記錄

2.2.2.1 MSCs細(xì)胞生長記錄

圖3 MSCs活細(xì)胞總數(shù)（TNC）對(duì)比（數(shù)據(jù)來自驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室）Fig.3 Total number of viable MSCs

2.2.2.2 內(nèi)毒素及無菌檢測

表3 MSCs內(nèi)毒素及無菌檢測記錄（數(shù)據(jù)來自驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室）Tab.3 MSCs endotoxin and sterility test records

2.2.2.3 驗(yàn)證結(jié)論

連續(xù)2代MSCs細(xì)胞培養(yǎng)，蜂巢培養(yǎng)箱組所獲得的MSCs活細(xì)胞總數(shù)（TNC）均高于傳統(tǒng)培養(yǎng)箱組，但二者均無明顯差異（P＞0.05）。代次一，蜂巢培養(yǎng)箱組MSCs細(xì)胞的二倍擴(kuò)增時(shí)間明顯低于傳統(tǒng)培養(yǎng)箱組（P＜0.05），代次二，蜂巢培養(yǎng)箱組MSCs細(xì)胞的二倍擴(kuò)增時(shí)間低于傳統(tǒng)培養(yǎng)箱組，但二者無顯著差異（P＞0.05）。內(nèi)毒素及無菌檢測結(jié)果均為陰性，蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)能夠有效提供無菌保障。

結(jié)論：D級(jí)環(huán)境背景下蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)可以根據(jù)需要提供適宜的MSCs生長環(huán)境及無菌性保證，滿足以T細(xì)胞治療產(chǎn)品制備生產(chǎn)工藝要求。

2.3 蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)在細(xì)胞藥品化生產(chǎn)中的應(yīng)用總結(jié)

T細(xì)胞及MSCs培養(yǎng)是細(xì)胞治療產(chǎn)品培養(yǎng)生產(chǎn)的典型代表，分別代表了免疫細(xì)胞治療及干細(xì)胞治療培養(yǎng)技術(shù)，其培養(yǎng)的參數(shù)條件要求同樣適應(yīng)于其他細(xì)胞治療產(chǎn)品培養(yǎng)。驗(yàn)證結(jié)果表明蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)在滿足法規(guī)的基礎(chǔ)上，可根據(jù)需要提供適宜的T細(xì)胞、MSCs生長環(huán)境及無菌性保證，滿足細(xì)胞藥品化生產(chǎn)的培養(yǎng)工藝要求，該結(jié)論也同樣適應(yīng)于其他細(xì)胞治療產(chǎn)品。因此，蜂巢培養(yǎng)箱系統(tǒng)可廣泛應(yīng)用于多種細(xì)胞治療產(chǎn)品的細(xì)胞藥品化生產(chǎn)。

3 結(jié)束語

蜂巢培養(yǎng)系統(tǒng)從GMP合規(guī)性出發(fā)并結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝要求，滿足多種細(xì)胞培養(yǎng)工藝要求并大幅提高生產(chǎn)效率，是細(xì)胞藥品化、規(guī)?；a(chǎn)的有效解決方案，可廣泛應(yīng)用于多種細(xì)胞治療產(chǎn)品的藥品化生產(chǎn)。我國目前大多數(shù)細(xì)胞治療技術(shù)產(chǎn)品處于研發(fā)及IND申報(bào)階段，蜂巢培養(yǎng)箱系統(tǒng)的法規(guī)符合性優(yōu)勢，可有力支持研發(fā)和IND申報(bào)，進(jìn)而推動(dòng)細(xì)胞治療產(chǎn)品發(fā)展。