王建榮 李阿麗 汪寶堆

摘要：采用一鍋式仿生礦化法形成轉(zhuǎn)化酶@ZIF-8，并通過(guò)羧甲基纖維素改性，改變ZIF-8的分散性。用血糖儀檢測(cè)轉(zhuǎn)化酶水解蔗糖產(chǎn)生的葡萄糖濃度，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)癌細(xì)胞的診斷。在形成ZIF-8的過(guò)程中，轉(zhuǎn)化酶的加入大大縮短了ZIF-8的形成時(shí)間，而且轉(zhuǎn)化酶與Zn2+之間有靜電作用，加速了生物礦化過(guò)程。通過(guò)對(duì)羧甲基纖維素（CMC）的修飾，羧甲基纖維素與ZIF-8之間存在靜電作用，改變了英威騰酶@ZIF-8的分散性。重要的是，這是第一次CMC改變了ZIF-8在生物仿生礦化過(guò)程中的穩(wěn)定性和分散性，并被用于便攜式血糖儀對(duì)癌細(xì)胞的早期診斷。基于這些發(fā)現(xiàn)，我們證明這種方法適用于檢測(cè)不同數(shù)量的癌細(xì)胞，表明我們制備的Invertase@ZIF-8@CMC可以用于便攜式血糖儀的癌癥早期診斷。

1.前言

最近，MOFs封裝的蛋白質(zhì)的仿生礦化引起了人們的極大興趣。由于其仿生礦化的封裝結(jié)構(gòu)，它們可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的活性，提高其在各種變性條件下的穩(wěn)定性。同時(shí)，生物樣本和實(shí)際血液樣本可以被長(zhǎng)期保存。保證了實(shí)際生物樣本、血樣的運(yùn)輸，并保持其生物活性，解決了生物活性和運(yùn)輸?shù)膯?wèn)題，具有良好的研究意義。然后，仿生礦化MOFs封裝的蛋白質(zhì)在穩(wěn)定性和分散性方面仍然存在挑戰(zhàn)。MOFs已經(jīng)被應(yīng)用于各種有價(jià)值的材料，包括氣體儲(chǔ)存、催化和吸附分離。本文選擇了低細(xì)胞毒性和可生物降解的MOFs。沸石咪唑骨架-8（ZIF-8），由Zn2+和2-甲基咪唑（2-HmIm）之間的配合形成。通過(guò)精細(xì)控制2-HmIm與Zn2+的濃度比，我們引入了一種簡(jiǎn)單的一鍋式仿生礦化方法來(lái)合成納米級(jí)MOFs，以封裝高負(fù)荷蛋白質(zhì)。

2.實(shí)驗(yàn)

2.1材料

六水硝酸鋅（Zn（NO3）2-6H2O）購(gòu)自成都科隆化學(xué)試劑廠。羧甲基纖維素（CMC）購(gòu)自Macklin，N， N-二甲基甲酰胺（DMF）、氯仿（CHCl3）、乙醇（C2H5OH）、冰醋酸（CH3COOH）購(gòu)自利安隆博華（天津）藥物化學(xué)有限公司。蔗糖、Na2HPO4、麥芽糖和CH3COONa購(gòu)自天津廣福精細(xì)化工研究所。D-葡萄糖、D-果糖購(gòu)自上海三友試劑廠。過(guò)氧化氫（H2O2，30%）購(gòu)自四川西橋化工股份有限公司。

2.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程

將5 mL 40 mM （0.5268 g） Zn（NO3）2-6H2O和5 mL 160 mM （1.576 g） 2-HmIm加入到20 mL玻璃瓶中，并將混合物放置24小時(shí)。最后，對(duì)混合物進(jìn)行離心洗滌，并進(jìn)行干燥，得到ZIF-8的白色粉末。稱取60.9毫克的羧甲基纖維素鈉，加入到30毫升的蒸餾水中并充分?jǐn)嚢琛＜尤雰傻螡恹}酸，將混合物磁力攪拌并保持24小時(shí)。最后，將反應(yīng)混合物對(duì)著透析袋透析三天，直到溶液的pH值為中性，收集溶液并儲(chǔ)存起來(lái)以備后。將80毫克的Invertase加入到5毫升的40mM（0.5268克）Zn（NO3）2-6H2O中并充分?jǐn)嚢韬?，?毫升的160mM（1.576克）的2-HmIm加入到上述混合物中，然后將混合物放置5分鐘。最后，將得到的混合物離心洗滌，并干燥，得到Invertase@ZIF-8白色粉末。稱出20毫克Invertase@ZIF-8白色粉末，加入10毫升10%的CMC-COOH溶液中，在室溫下磁力攪拌24小時(shí)。最終得到Invertase@ZIF-8@CMC溶液。取10mL制備好的Invertase@ZIF-8@CMC溶液，然后加入100uL活化的FA-NH2溶液，將混合物在室溫下暗中攪拌24小時(shí)。最后得到Invertase@ZIF-8@CMC@FA溶液，并在黑暗中保存以備將來(lái)實(shí)驗(yàn)使用。

3結(jié)果和討論

3.1材料的合成和表征

用SEM和TEM來(lái)表征ZIF-8、Invertase@ZIF-8、Invertase@ZIF-8@CMC的形貌。如圖1所示，分別是ZIF-8、Invertase@ZIF-8、Invertase@ZIF-8@CMC的SEM和TEM圖像。從圖1a，1d可以看出，Zn2+和2-甲基咪唑（2-HmIm）之間的配位形成的ZIF-8是一個(gè)十二面體的形狀。從圖1b、1e可以看出，通過(guò)仿生礦化過(guò)程形成的Invertase@ZIF-8可以保持ZIF-8的形態(tài)，而加入蔗糖酶可以明顯縮短ZIF-8的形成時(shí)間。從圖1c和1f可以看出，羧甲基纖維素（CMC）被涂在ZIF-8的表面。

3.2如圖2a所示，ZIF-8和模擬ZIF-8的XRD特征衍射峰圖譜完全一致。ZIF-8的XRD特征衍射峰（011）、（002）、（112）、（022）、（013）、（222）、（114）、（233）、（134）、（144）。同樣，Invertase@ZIF-8和模擬ZIF-8的XRD特征衍射峰譜也完全一致。解釋Invertase@ZIF-8生物仿生礦化過(guò)程的完成。從FT-IR（圖2b）可以看出，Invertase@ZIF-8，1640cm-1代表Zn和蔗糖酶C=0的存在，進(jìn)一步說(shuō)明ZIF-8中Invertase的存在。在Invertase@ZIF-8@CMC中，我們可以看到1600 cm-1和2445 cm-1的強(qiáng)吸收帶，表明纖維素（CMC）中存在-COO-功能團(tuán)。在Invertase@ZIF-8@CMC@FA的紅外圖像中，1670 cm-1對(duì)應(yīng)于葉酸（FA）中存在的-NH2-功能團(tuán)。如圖2c所示，Invertase@ZIF-8@CMC的熱重分析經(jīng)歷了幾個(gè)階段的重量損失。在25-270℃的溫度范圍內(nèi)，Invertase的第一次損失是由于吸附的水的分解。在270-340℃的溫度范圍內(nèi)的第二次失重對(duì)應(yīng)于英威騰酶的分解，在340℃后失重基本保持不變，表明英威騰酶的分解幾乎已經(jīng)完成。ZIF-8在25-160℃溫度范圍內(nèi)的第一次損失是由于吸附的水的分解。在160-233℃的溫度范圍內(nèi)的第二次失重與結(jié)合水的分解有關(guān)。在233-800℃的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的第三次失重與ZIF-8的分解有關(guān)，同時(shí)結(jié)構(gòu)塌陷。從圖2c可以看出，Invertase@ZIF-8和ZIF-8的熱分解趨勢(shì)和分解溫度是一樣的，Invertase@ZIF-8的分解趨勢(shì)更加明顯。通過(guò)比較ZIF-8和Invertase@ZIF-8在270-340℃時(shí)的最大分解，在這個(gè)溫度下正好對(duì)應(yīng)于Invertase的分解，我們可以發(fā)現(xiàn)Invertase的負(fù)載為10wt%。

如圖3a所示，ZIF-8的比表面積（BET）為1376.4m2/g，而Invertase@ZIF-8的比表面積（BET）為989.2m2/g。我們發(fā)現(xiàn)，加入Invertase后，比表面積比原來(lái)的ZIF-8減少了387.2 m2/g，Invertase進(jìn)入ZIF-8并占據(jù)其孔隙，導(dǎo)致BET的下降。如圖3b所示，從紫外-可見光譜可以看出，ZIF-8、Invertase@ZIF-8、Invertase@ZIF-8@CMC都沒有明顯的紫外吸收峰，但在Invertase@ZIF-8@CMC@FA中，在279nm和345nm處有明顯的吸收。在345納米處有一個(gè)明顯的葉酸紫外吸收峰，進(jìn)一步表明材料中存在葉酸（FA）。我們之前已經(jīng)證明了葉酸在紅外線中存在一個(gè)-NH2-功能團(tuán)。

3.3敏感地檢測(cè)癌細(xì)胞，用于癌癥的早期診斷

在應(yīng)用前評(píng)估了Invertase@ZIF-8@CMC的細(xì)胞毒性活性，并用于癌細(xì)胞檢測(cè)。用Invertase@ZIF-8@CMC培養(yǎng)細(xì)胞活力，HeLa細(xì)胞的Invertase@ZIF-8@CMC在48小時(shí)內(nèi)保持在30微克/毫升，表明Invertase@ZIF-8@CMC@FA的細(xì)胞毒性低。為了證明該探針的潛在臨床用途，該傳感器還被用于檢測(cè)全血中的HeLa細(xì)胞。如圖5a所示，血糖儀讀數(shù)的變化隨著Invertase@ZIF-8@CMC濃度的變化而變化。我們測(cè)試了HeLa細(xì)胞（過(guò)量表達(dá)葉酸受體）和葉酸受體表達(dá)不足的NIH3T3細(xì)胞來(lái)表征Invertase@ZIF-8@CMC的性能。將Invertase@ZIF-8@CMC@FA培養(yǎng)一小時(shí)。然后用PBS緩沖液清洗細(xì)胞，以去除不粘附在細(xì)胞表面的物質(zhì)，并加入蔗糖溶液進(jìn)行反應(yīng)。如圖5b所示，相同數(shù)量的HeLa和NIH3T3細(xì)胞的血糖儀讀數(shù)的變化。這一結(jié)果清楚地表明，通過(guò)葡萄糖濃度的變化可以很容易地識(shí)別出FA陽(yáng)性的癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的差異。如圖6c所示，用Invertase@ZIF-8@CMC培養(yǎng)不同數(shù)量的HeLa細(xì)胞。隨著細(xì)胞數(shù)量的增加，血糖儀所測(cè)得的PGM讀數(shù)不斷增加，并顯示出良好的線性相關(guān)性。因此，這種血糖儀檢測(cè)葡萄糖濃度變化的檢測(cè)平臺(tái)對(duì)于高靈敏度和快速的早期癌癥診斷是非常理想的，在臨床和護(hù)理點(diǎn)有潛在的應(yīng)用，在生物醫(yī)學(xué)和癌癥診斷方面有重要的應(yīng)用前景。

4.結(jié)論

綜上所述，制備的分散性Invertase@ZIF-8@CMC被應(yīng)用于便攜式血糖儀的癌癥早期診斷。Invertase@ZIF-8是通過(guò)一鍋式仿生物礦化法形成的。生物相容性的羧甲基纖維素（CMC）涂層改變了ZIF-8的分散性，提供了良好的穩(wěn)定性和分散性。形成的Invertase@ZIF-8還顯示出優(yōu)良的蛋白質(zhì)活性和保護(hù)蛋白質(zhì)免受酶介導(dǎo)的降解。此外，Invertase@ZIF-8@CMC@FA首先與癌細(xì)胞上的葉酸受體發(fā)生作用。我們使用便攜式血糖儀檢測(cè)蔗糖水解產(chǎn)生葡萄糖的酶促作用。我們提供了一種合成分散性Invertase@ZIF-8@CMC材料的新方法，其合成路線簡(jiǎn)單，成本低，便于攜帶，靈敏度高，并能識(shí)別不同的癌細(xì)胞，用于癌癥早期臨床癥狀的診斷。因此，它可以作為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床領(lǐng)域的候選材料。

* 通信作者：汪寶堆（1968-）， 男，漢，甘肅定西人，教授，博士 ，Email：wangjr_123@163.com，研究方向?yàn)樯铩?/p>