歐興坤 李文桂

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲病研究所400016

銅綠假單胞菌具有代謝多樣性的特點，在環(huán)境中廣泛分布，是重要的機會致病菌，常導致免疫功能受損患者的多種感染[1-2]。使用抗菌藥物是目前防治銅綠假單胞菌感染的主要方法，但銅綠假單胞菌存在多種耐藥機制（低外膜滲透性、外排泵、滅活酶和生物膜生成等），還可通過質粒、轉座子（Tn）或整合子（In）等可移動基因原件（MGE）來傳播藥物抗性，其耐藥表型也呈現(xiàn)多耐藥到泛耐藥。有效的疫苗可減少銅綠假單胞菌感染，減緩耐藥菌的出現(xiàn)與傳播，彌補抗菌藥物化療的不足，是銅綠假單胞菌感染防治的潛在策略之一[3-4]。

LasR蛋白是銅綠假單胞菌群體感應las系統(tǒng)的信號分子受體，與3-氧代十二烷基-高絲氨酸內酯結合，參與銅綠假單胞菌300多個基因的轉錄調控，這些基因負責銅綠假單胞菌眾多毒力因子的產生，包括多種蛋白酶和次級代謝物等[5]，是銅綠假單胞菌疫苗研制的潛在靶點之一[6]?；蚬こ袒脑鞙p毒致病菌或者益生菌研制的活菌載體疫苗可激發(fā)宿主的多種免疫應答[7]，對銅綠假單胞菌疫苗研制有重要應用價值。本研究以pGEX-1λT為載體，構建lasR基因的重組質粒，并研究其在原核系統(tǒng)中的表達效率，為研究糞腸球菌介導的銅綠假單胞菌疫苗奠定基礎。

材料與方法

一、實驗材料

1.菌株與質粒

E.coliBL21（DE3）株、銅綠假單胞菌PA01株、質粒pGEX-1λT、LB培養(yǎng)基以及銅綠假單胞菌感染的小鼠血清由重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲病研究所保存。

2.主要試劑

DNA標記物、T4 DNA連接酶、BamHⅠ和EcoRⅠ內切酶購自Fermentas公司；中分子量蛋白標記物購自北京鼎國興盛生物技術公司；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）、考馬斯亮藍、細菌基因組DNA提取試劑盒、質粒小量提取試劑盒、PCR試劑盒、PCR產物純化試劑盒、感受態(tài)細胞制備試劑盒、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）購自上海生工公司；HRP標記的羊抗鼠抗體購自北京鼎今生物科技公司。

3.主要儀器

電穿孔儀和高速離心機為Eppendorf公司；PCR儀和凝膠成像分析儀為Bio-Rad公司。

二、lasR基因的擴增與鑒定

設計lasR基因擴增引物，由上海生工合成。P1（上游引物）：5'-GCGGATTC-ATGGCCTTGGTTGACGGTTTTCTTG-3'；P2（下游引物）：5'-GCGAATTCGAGAGTAATAAGACCCAAATTAACGGC-3'，下劃線處為酶切位點。提取銅綠假單胞菌PA01株基因組DNA，以此為模板進行PCR擴增lasR基因，反應條件為：95℃預變性5 min，（95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min）循環(huán)30次，72℃延伸10 min。取5.0μL PCR擴增產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

三、重組質粒pGEX-LasR的構建

將lasR基因擴增產物和載體pGEX-1λT分別進行雙酶切，酶切反應體系為：PCR產物或質粒pGEX-1λT各取42.0μL，10×Tango Buffer 6.0μL，去離子水9.4μL，分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ內切酶各1.3μL，37℃孵育2 h。按PCR純化試劑盒操作說明，將酶切產物進行純化，然后按如下體系進行連接反應：lasR基因片段6.0μL、pGEX-1λT 9.0μL，T4 DNA連接酶（10 U/μL）2.0μL，10×T4 Buffer 2.0μL。反應體系置于4℃下連接過夜，水?。?0℃10 min）滅活連接酶。

四、重組質粒pGEX-LasR的電轉化

按試劑盒操作說明制備感受態(tài)E.coliBL21（DE3），取80.0μL感受態(tài)細胞與20.0μL連接產物混勻，冰浴1 min，轉移至1.0 mm電穿孔杯中進行電轉化，電轉化參數(shù)為：電壓1.2 kV，時間5 ms，轉化次數(shù)1～5次。電穿孔完畢后加入1.0 mL LB培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h（37℃，150轉/min，離心半徑2.0 cm），然后挑取適量菌液接種于含50μg/mL氨芐青霉素的LB選擇平板上培養(yǎng)48 h。在選擇平板上挑取單個克隆接種于含50μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)48～72 h（37℃，200轉/min，離心半徑2.5 cm），提取質粒進行PCR和雙酶切鑒定（反應條件同前）。

五、重組質粒pGEX-LasR的誘導表達

將經PCR和雙酶切鑒定的重組BL21（pGEXLasR）接種到LB液體培養(yǎng)基（含50μg/mL的氨芐青霉素）中，培養(yǎng)至A600達到0.5～0.8時（37℃，200轉/min，離心半徑2.5 cm），取少量菌液作為對照，然后加入IPTG（終濃度1 mol/L）進行誘導表達，在誘導時間為1、3、5、7、9、11和13 h分別取1.0 mL菌液，離心收集菌體沉淀煮沸裂解后進行SDSPAGE電泳，采用考馬斯亮藍進行染色后，用凝膠成像儀掃描分析蛋白的表達情況。

六、Western印跡法鑒定表達產物

細菌裂解液經SDS-PAGE電泳后，切下蛋白標記物條帶進行考馬斯亮藍染色，其余部分采用半干法（恒流150 mA，2 h）將凝膠蛋白轉移至NC膜。轉膜結束后用PBS漂洗3次，每次5 min；采用5%的脫脂奶粉溶液封閉2 h，PBS漂洗（5 min，3次）；加入1∶100稀釋的銅綠假單胞菌感染的小鼠血清（100.0μL血清，10.0 mL封閉液），室溫孵育2 h，PBS漂洗（5 min，3次）；加入HRP標記的羊抗鼠抗體（10.0μL抗體，10.0 mL封閉液），室溫孵育2 h；PBS漂洗（5 min，3次），加入DAB避光顯色15 min；取出NC膜與染色后的標記物條帶一起成像分析。

結 果

一、lasR基因的擴增與鑒定

以PA01基因組DNA為模板擴增lasR基因，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，出現(xiàn)大小約717 bp的條帶（如圖1），與目的基因相符。

圖1 lasR基因PCR擴增產物鑒定

二、重組質粒pGEX-LasR的PCR鑒定

提取重組菌的質粒為模板進行PCR（如圖2），擴增出大小約為717 bp的條帶，與lasR基因大小相符。

圖2 重組質粒pGEX-LasR的PCR鑒定

三、重組質粒pGEX-LasR的雙酶切鑒定

重組質粒與空載體分別進行酶切后，酶切產物采用1.2%瓊脂糖電泳進行檢測（如圖3），重組質粒出現(xiàn)大小約4 947 bp的載體條帶和717 bp的lasR基因條帶，而空載體無717 bp的條帶。

四、表達產物的SDS-PAGE分析

取未誘導以及不同時間誘導的細菌裂解后進行SDS-PAGE分析，結果如圖4，經IPTG誘導后出現(xiàn)相對分子質量約為53 000的蛋白條帶，與重組GST-LasR蛋白理論值大小相符（GST 26 000，LasR 27 000）。凝膠成像儀分析顯示在誘導3～5 h表達量較高，最高可達21%。

圖4 重組BL21表達產物的SDS-PAGE分析

五、重組蛋白的Western印跡試驗鑒定

以銅綠假單胞菌感染的小鼠血清作為一抗進行Western印跡試驗檢測，結果如圖5，發(fā)現(xiàn)該血清可特異性識別經IPTG誘導的重組菌所表達的分子量約為53 000的蛋白條帶，未誘導組無此條帶。

圖5 重組BL21表達產物的Western印跡試驗鑒定

討 論

銅綠假單胞菌是一種耐藥問題較為嚴重的常見機會性致病菌，采用疫苗防治其感染是具有極高應用價值的科學手段之一，但目前銅綠假單胞菌疫苗的研制仍面臨巨大挑戰(zhàn)[8]。本課題組構建了屎腸球菌介導的銅綠假單胞菌疫苗[9]，它可刺激宿主的免疫系統(tǒng)產生對目標病原體的保護力，其優(yōu)勢在于：（1）載體本身可發(fā)揮免疫佐劑的作用；（2）改進抗原的遞送途徑；（3）能夠刺激宿主的多種免疫應答，包括細胞免疫、體液免疫以及黏膜免疫；（4）通過與病原菌競爭，抑制感染的發(fā)生與發(fā)展[10]。Drolia等[11]以干酪乳桿菌ATCC334株為載體表達非致病性李斯特菌的黏附蛋白（LAP），發(fā)現(xiàn)工程菌可在腸內定植，減少單核細胞增生李斯特菌的黏膜定植和全身播散，并保護小鼠免受致命感染，還能募集FOXP3+T細胞、CD11c+DC和NK細胞來增加腸道免疫調節(jié)功能。

LasR是LuxR調控蛋白家族的成員之一，由716 bp的開放閱讀框編碼，相對分子質量大小約27 000[12]。LasR包含兩個功能結構域：一個N端的信號分子結合結構域和一個C端的含有螺旋-轉角-螺旋（HTH）結構的DNA結合結構域。LasR的N端可折疊形成疏水區(qū)，其中Tyr-56、Trp-60、Asp-73和Ser-129殘基呈現(xiàn)高度保守，與信號分子相互作用可形成二聚體。LasR二聚體提供了2個HTH基序，以更高的親和力與啟動子結合產生穩(wěn)定的調控作用，從而促進堿性蛋白酶、彈性蛋白酶和外毒素A等毒力因子的產生[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)在沒有信號分子的大腸埃希菌中，轉入lasR基因也可表達出具有活性的LasR蛋白[15]。在感染過程中，多種因素可刺激lasR的高水平表達，包括銅綠假單胞菌的種群密度、碳限制、鐵濃度和氧化應激等[16-17]。本研究以銅綠假單胞菌PA01株DNA為模板成功擴增出了717 bp的lasR基因，為構建重組pGEX-LasR提供了條件。

通過重組質粒表達外源蛋白是活菌工程疫苗的重要技術手段之一，具有易于制備和表達效率高的特點。本研究所使用的pGEX-1λT是一種穿梭質粒，含有pBR322復制起始序列和tac強啟動子，在細胞內拷貝數(shù)較高，是一種表達外源蛋白的高效載體。梁誠誠和李文桂[18]以pGEX-1λT為載體，構建了銅綠假單胞菌的外膜蛋白OprF/OprI融合基因的重組質粒，電穿孔轉化兩歧雙歧桿菌，經IPTG誘導可高效表達具有免疫反應性的OprF-I融合蛋白，在誘導3～5 d表達量可達菌體總量的18%。pGEX-1λT包含lacI阻遏基因、氨芐青霉素抗性基因和多克隆位點（MCS），在MCS上游含有促進外源基因表達的SD序列和谷胱甘肽巰基轉移酶（GST）編碼序列。GST可增加重組蛋白的可溶性，并且保持蛋白質的生物活性，廣泛應用于蛋白質的純化與功能研究。謝軼等[6]構建的重組質粒lasR-pGEX4T-1在大腸埃希菌中誘導表達，純化獲得GST-LasR蛋白，用該重組蛋白免疫BALB/c鼠，在免疫后兩周可檢測到特異性抗體，組織病理學檢查顯示免疫組小鼠肺部炎癥反應顯著減輕，并且降低了肺組織的細菌負荷，提示GST-LasR可刺激小鼠免疫系統(tǒng)產生對銅綠假單胞菌的抵抗力。本研究以pGEX-1λT為載體，構建了pGEX-LasR重組質粒，以電穿孔的方式轉入大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)，IPTG誘導可表達出相對分子質量大小約為53 000的GST-LasR融合蛋白，該融合蛋白可與銅綠假單胞菌感染的鼠血清發(fā)生特異反應，SDS-PAGE顯示在誘導第3～5小時表達較高，最高可達菌體總量的21%。

綜上所述，本研究成功構建了lasR基因的原核表達載體pGEX-LasR，該重組質粒能在大腸埃希菌BL21（DE3）中表達具有免疫反應性的LasR重組蛋白，為銅綠假單胞菌疫苗的研制打下了基礎。但本研究只采用Western印跡試驗初步檢測了LasR重組蛋白的免疫原性，其在動物模型中的免疫保護效果和重組蛋白的表達效率等均有待進一步研究和優(yōu)化提高。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突