婁樹寶 李鳳云 田國奎 王海艷 田振東 王立春 劉喜才 王輝

馬鈴薯種質(zhì)資源晚疫病抗性評價及分子標記輔助篩選

婁樹寶1李鳳云1田國奎1王海艷1田振東2王立春1劉喜才1王輝1

（1黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院克山分院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬鈴薯生物學與遺傳育種重點實驗室，161005，黑龍江齊齊哈爾；2華中農(nóng)業(yè)大學/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬鈴薯生物學與生物技術(shù)重點實驗室，430070，湖北武漢）

由致病疫霉（）引起的晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)上最具危害性的病害，種植抗病品種是防治該病害最有效的方法。分子標記輔助選擇可以大大縮短育種年限，提高育種效率。對395008.45×克新27號的60份雜交后代進行了晚疫病抗性評價，結(jié)果有39份表現(xiàn)抗病，21份表現(xiàn)感病。利用晚疫病抗性基因的分子標記對60份雜交后代進行了檢測，其中有43份含有基因；對36份種質(zhì)資源進行檢測，其中有28份含有基因。本研究鑒定的抗性資源可為馬鈴薯抗病育種提供優(yōu)質(zhì)的親本材料。

馬鈴薯；晚疫?。环肿訕擞?/p>

馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉（）引起的具有毀滅性的病害之一。目前晚疫病防控以化學藥劑為主，但由于成本較高，且長期使用會造成環(huán)境污染，也會使病原菌產(chǎn)生抗藥性，加快其變異進程，因此，種植抗病品種仍是防控馬鈴薯晚疫病最經(jīng)濟有效和環(huán)境友好的途徑。早期品種抗性改良主要通過向栽培種中導入野生種的主效抗性基因。然而，目前主栽品種主要由國外有限的數(shù)個品種和品系選育而成，導致遺傳背景相對狹窄，抗病基因的數(shù)目和類型有限，抗性頻繁喪失，限制了應用推廣[1]。馬鈴薯中已經(jīng)克隆了大約30個抗晚疫病基因及其同源基因，并開發(fā)了相應的分子標記，有效地提高了晚疫病抗性育種效率[2-3]。研究表明，將多個基因聚合在同一個馬鈴薯材料中可以提高晚疫病田間抗性，也有研究認為，利用具有數(shù)量抗性的材料選育品種能夠減小對病原菌的選擇壓力，因此更傾向于使用具有數(shù)量抗性的材料進行晚疫病抗病育種[4]。

然而，近些年來的研究[5]表明一些主效基因的抗性也表現(xiàn)為數(shù)量抗性表型，即所謂的主效基因也可以解釋數(shù)量抗性性狀。主效基因被克服通常是因為其對病原菌的選擇壓較大，而數(shù)量抗性基因只具有局部、微弱的效應，對病原菌的選擇壓較小[6]。例如，水稻白葉枯抗病基因就被認為是一個可以對多個白葉枯菌[pv.（）]小種起到抗病作用的“被克服了的”基因[7]。在馬鈴薯中，晚疫病抗性鑒別寄主MaR8、MaR9 和MaR10在田間都表現(xiàn)出廣譜抗性和數(shù)量抗性的特點[8-9]。對具有晚疫病數(shù)量抗性的B3群體、Sarpo Mira、Stirling以及其他品種的多年抗性鑒定結(jié)果表明它們能夠提供持久的晚疫病抗性。研究[10]證實，具有數(shù)量抗性表型的基因，田間和接種鑒定均表現(xiàn)出一定程度的病原侵染，發(fā)病較慢，因此病原菌受到的選擇壓沒有其他主效基因劇烈，使病原菌的協(xié)同進化過程變慢，抗性能夠較長時期地保存下來，基因廣泛地存在于不同類型的馬鈴薯材料中，且具有較好的田間抗性。

本試驗采用田間自然發(fā)病和室內(nèi)人工接種鑒定2種方法對馬鈴薯60份雜交后代和36份種質(zhì)資源進行晚疫病抗性鑒定，結(jié)合病情指數(shù)和病斑面積對馬鈴薯材料的晚疫病抗性進行評價；鑒于含有基因的抗性材料在田間表現(xiàn)廣譜抗性和持久抗性，應用基因分子標記對育種后代和親本材料進行篩選，快速檢測馬鈴薯材料中是否含有基因，實現(xiàn)分子標記輔助選擇，加快馬鈴薯晚疫病抗性育種進程，為今后馬鈴薯聚合抗病育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

395008.45、克新27號及其60份雜交后代，以及36份馬鈴薯種質(zhì)資源由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院克山分院提供。

1.2 晚疫病田間調(diào)查

試驗材料種植于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院克山分院試驗地，進行田間晚疫病發(fā)生情況調(diào)查，在所有馬鈴薯植株葉片完全展開后，每周觀察植株發(fā)病情況，統(tǒng)計各馬鈴薯品種（系）的病級，采用病情指數(shù)法計算馬鈴薯品種（系）晚疫病病情指數(shù)[11]，病情指數(shù)為3次調(diào)查的平均值。

病情指數(shù)＝∑（各級病葉數(shù)×相對病級數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×9）×100。

病級標準如下：0級，無病斑；1級，病斑面積占整個葉面積5%以下；3級，病斑面積占整個葉面積6%～10%；5級，病斑面積占整個葉面積11%～20%；7級，病斑面積占整個葉面積21%～50%；9級，病斑面積占整個葉面積50%以上。

田間抗病性級別標準為病情指數(shù)低于30為高抗（HR），31～50為中抗（MR），51～70為中感（MS），70以上為高感（HS）。

1.3 晚疫病菌人工接種鑒定

采用田間分離的晚疫病菌株KS09-7（生理小種1、2、3、4、5、6、7、8、10、11）和KS11-26（生理小種3、4、6、7、8、11）混合接種。將晚疫病菌經(jīng)18℃黑暗培養(yǎng)10～15d，用無菌水沖洗，過濾除去菌絲，將收集到的孢子囊置于4℃的冰箱內(nèi)2～3h，以刺激游動孢子的釋放，將濃度調(diào)到1×105個/mL待用。植株生長至現(xiàn)蕾階段，采摘無病斑、大小適中、表面平整的葉片，背面朝上放在鋪有無菌濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，用配制好的游動孢子懸浮液接種，每個葉片背面接種20μL孢子懸浮液，每份材料接種4片葉，重復3次，置于18℃～20℃保濕培養(yǎng)（每天16h光照，8h黑暗）。接種5d后開始觀察葉片背面有無病斑、孢子囊以及霉層，統(tǒng)計病斑面積，游標卡尺記載病斑的長（L）和寬（W）（兩者垂直），連續(xù)統(tǒng)計3d。根據(jù)病斑長和寬計算病斑面積（ellipse area）A=1/4×π×L×W。

采用劉龍超等[12]的方法進行抗性分級，從最明顯感病的孢子化病斑到最明顯抗病的原位壞死的病情指數(shù)分別記為1～5級（圖1）。接種葉片全部布滿白色的病菌孢子記為病情指數(shù)1（高感，HS）；葉片大部分枯萎壞死但未出現(xiàn)白色菌絲孢子記為病情指數(shù)2（感病，S）；葉片自接種點出現(xiàn)較大擴展病斑且病斑周圍輪廓清晰記為病情指數(shù)3（中抗，MR）；葉片自接種點出現(xiàn)較小擴展病斑且病斑干燥記為病情指數(shù)4（抗病，R）；葉片在接種點上出現(xiàn)原位壞死記為病情指數(shù)5（高抗，HR）。

圖1 離體馬鈴薯葉片晚疫病抗性鑒定標準

1.4 馬鈴薯DNA提取以及晚疫病抗性基因檢測

采集馬鈴薯幼嫩葉片，立即放入裝有冰袋的密封采集箱中備用。采用CTAB法提取基因組DNA，利用核酸蛋白分析儀檢測DNA濃度，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度?；蛱禺愋詷擞浶畔⒂扇A中農(nóng)業(yè)大學田振東教授提供。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯雜交后代晚疫病抗性鑒定

以395008.45為母本、克新27號為父本及其60份雜交后代（編號1～62）為供試材料，于2018-2019年連續(xù)2年對其進行田間抗性和室內(nèi)接種抗性鑒定，結(jié)果（表1）顯示后代材料中39份田間表現(xiàn)抗病，21份材料表現(xiàn)感??；室內(nèi)接種鑒定結(jié)果與田間調(diào)查結(jié)果基本一致，室內(nèi)接種抗性要低于田間。通過多年調(diào)查，克新27號在田間晚疫病抗性表現(xiàn)為高抗，并且抗性能夠穩(wěn)定遺傳給子代，以克新27號為親本的雜交組合，后代中表現(xiàn)抗病的比例較大，可以作為晚疫病抗性育種的重要親本材料加以利用。克新27號室內(nèi)接種鑒定為抗病，子代中有高抗的材料，表現(xiàn)超親優(yōu)勢。

2.2 36份馬鈴薯種質(zhì)資源晚疫病抗性鑒定

2016-2018年連續(xù)3年對230份育種親本進行晚疫病抗性跟蹤調(diào)查，從中選取36份（編號63～98）田間表現(xiàn)抗病的材料進行室內(nèi)接種鑒定，結(jié)果（表1）顯示，其中7份材料表現(xiàn)感病，與田間抗性不一致。根據(jù)多年觀察，克新19號剛開始推廣時晚疫病抗性較好，經(jīng)過多年種植后抗性基本喪失，原因是晚疫病菌生理小種不斷變化，新的小種克服抗性基因，所以應不斷發(fā)掘新的抗性基因，通過多種手段聚合到新品種中，增強其晚疫病持久抗性。

表1 馬鈴薯種質(zhì)資源和雜交后代晚疫病抗性鑒定

表續(xù)表1 Table 1 (continued)

2.3 馬鈴薯種質(zhì)資源及雜交后代抗性基因R8檢測

應用晚疫病抗性基因的特異性引物檢測了60份395008.45×克新27號的雜交后代，部分結(jié)果如圖2，含有基因的后代可以擴增出682bp的特異性片段，顯示43份含有基因，其中39份田間表現(xiàn)為抗病，4份田間表現(xiàn)感病，其余17份不含有基因，都表現(xiàn)為感病。說明父本克新27號含有的抗性基因能夠遺傳給子代，并且子代大多數(shù)個體含有基因。

M：DL2000 DNA標記，下同

應用晚疫病抗性基因的特異性引物檢測了36份多年田間表現(xiàn)抗病的材料（部分結(jié)果見圖3），檢測到其中28份含有基因，8份不含，其具有的抗性可能是由其他抗性基因提供的。這些資源是重要的抗病育種親本，可以利用其對一些抗性較差的品種進行改良，對育種具有重要意義。

圖3 馬鈴薯抗病種質(zhì)資源中抗性基因R8檢測

3 討論

抗病基因的發(fā)掘和多個抗病基因聚合是提高品種持久抗病性的重要手段，獲得優(yōu)異抗病種質(zhì)資源是培育抗病品種的基礎。本試驗中36份抗性資源有28份含有基因，在田間均具有較好的抗性，其余8份是否含有其他抗性基因需要進一步檢測，部分材料雖然含有基因，但田間卻表現(xiàn)感病，排除人為因素和標記準確度的影響，原因有待進一步研究。含有基因的抗性材料是否含有其他抗性基因還需要利用抗病基因分子標記去檢測和評價，這是改良作物抗病性的一種經(jīng)濟有效的方法，在不同作物中被廣泛應用[13-14]。本研究中含有基因的材料在田間和室內(nèi)接種鑒定時均表現(xiàn)出一定程度的病原侵染，病斑擴展較慢，也證實基因具有數(shù)量抗性表型，與蔣銳[10]研究結(jié)果一致。

部分材料田間與室內(nèi)接種鑒定存在差異，原因可能有，材料在田間具有廣譜抗性；材料生長環(huán)境不同，造成抗性水平上的差異；離體葉片接種鑒定發(fā)病普遍嚴重，可能是離體鑒定發(fā)病條件更適合；人為因素有時也會影響鑒定結(jié)果。離體葉片接種鑒定在室內(nèi)，溫濕度條件可控，能創(chuàng)造最適合晚疫病發(fā)病的條件，鑒定結(jié)果比較準確。但結(jié)果在不同生理小種之間也會存在差異，本試驗使用當?shù)氐膹姸玖ι硇》N和優(yōu)勢小種，通過多次重復接種，再與田間自然發(fā)病相結(jié)合，使鑒定結(jié)果更準確可靠。

晚疫病抗性基因的克隆和分子標記的開發(fā)加快了分子標記輔助選擇進程。將多個抗性基因聚合在同一份馬鈴薯材料中可提高晚疫病田間抗性[15]，有研究[16]表明含有的材料表現(xiàn)出高抗或中抗水平，說明RB標記在晚疫病抗性輔助選擇中具有高效性。Rietman等[5]分析了典型持久抗病品種Sarpo Mira的抗病基因組成，發(fā)現(xiàn)該品種抗性持久的原因是有多個抗病基因（至少5個）聚合到了一起。隨著越來越多抗性基因被克隆，我們要加大資源的評價范圍，篩選含有更多抗性基因的資源，應用常規(guī)育種或分子手段將其轉(zhuǎn)入到品種中，達到基因聚合的目的，培育具有持久抗性的馬鈴薯品種，真正達到常規(guī)育種與分子標記輔助選擇相結(jié)合。

4 結(jié)論

對36份馬鈴薯種質(zhì)資源和395008.45×克新27號的60份雜交后代進行晚疫病田間抗性調(diào)查和室內(nèi)離體葉片接種鑒定，部分材料鑒定結(jié)果有差異；對96份材料進行基因檢測，結(jié)果顯示，大部分表現(xiàn)抗病的材料都含有基因，部分感病材料中也含有基因。

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Evaluation of Germplasms for Resistance to Potato Late Blight and Molecular Markers Assisted Screening

Lou Shubao1, Li Fengyun1, Tian Guokui1, Wang Haiyan1Tian Zhendong2, Wang Lichun1, Liu Xicai1, Wang Hui1

(1Keshan Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Potato Biology and Genetics, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qiqihar 161005, Heilongjiang, China;2Huazhong Agricultural University/Key Laboratory of Potato Biology and Biotechnology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wuhan 430070, Hubei, China)

Potato late blight caused byhas always been a devastating disease in potato production. Use of resistant varieties is the most fundamental and effective way to control the disease. Molecular marker assisted selection can greatly shorten the breeding period, significantly improve the breeding efficiency. A total of 60 offspring of hybrid combinations of 395008.45×Kexin No.27 were evaluated for resistance to. The results showed that 39 materials were resistantance varieties and 21 materials were susceptible varieties. The molecular marker related to the resistance genewere used to detect 60 offspring and 36 potato germplasm resources, and 43 varieties (lines) and 28 varieties (lines) had resistance gene, respectively. The potato resistance germplasm resources tested could provide high-quality parental materials for disease resistance breeding.

Potato; Late blight; Molecular markers

10.16035/j.issn.1001-7283.2021.04.030

婁樹寶，從事馬鈴薯遺傳育種研究，E-mail：loushubao@163.com

黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院青年基金（2019YYYF017）；國家自然科學基金“基于抗病基因組學和效應子識別策略的馬鈴薯晚疫病抗性優(yōu)異基因資源鑒定、新抗病基因發(fā)掘與利用”（31761143007）

2020-10-27；

2020-12-03；

2021-06-29