張全芳 姜明松 陳峰 朱文銀 周學標 楊連群 徐建第

山東省水稻品種（系）的遺傳多樣性分析

張全芳1姜明松2陳峰2朱文銀2周學標2楊連群1徐建第2

（1山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物種質資源研究所，250100，山東濟南；2山東省農(nóng)業(yè)科學院濕地農(nóng)業(yè)與生態(tài)研究所，250100，山東濟南）

利用全自動DNA分析儀熒光SSR-PCR技術和農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《水稻品種鑒定技術規(guī)程SSR標記法（NY/T1433-2014）》中公布的48對SSR引物，對山東省育成和審定的48個水稻品種（系）進行遺傳多樣性分析。結果表明，有40對SSR引物在48個品種（系）間表現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)率為83.3%。檢測到等位基因133個，每對引物的等位基因數(shù)變幅為1～7個，平均3.32個。SSR引物的多態(tài)性信息量（PIC）變化范圍為0.0384～0.7333，平均值0.2560。標記指數(shù)（MI）的變化范圍在0.08～5.13，平均值0.93。48個水稻品種（系）間的遺傳相似系數(shù)（GSC）在0.6390～0.9859之間，平均值0.7800，89.6%品種（系）的GSC在0.7189～0.9859之間，親緣關系較近；以GSC為基礎，按UPGMA方法在閾值0.75處將48個品種（系）劃分為4大類群。由此可見，山東省育成和審定的水稻品種（系）遺傳多樣性不夠豐富，品種（系）間的親緣關系較近，需要進一步拓寬親本選擇范圍，擴大遺傳背景。

水稻；SSR標記；遺傳多樣性；聚類分析

山東水稻屬華北單季稻作帶，是重要的高產(chǎn)高效作物和生態(tài)作物，種植歷史悠久。1949年以來，山東水稻品種大致經(jīng)過4次大的更新[1]。1949-1959年初種植紫皮旱稻和竹竿青等地方品種；1960-1979年主要種植引進的農(nóng)墾57、桂花黃、農(nóng)墾39和農(nóng)墾40等品種；1980-1999年為引種和育種結合時期，主要種植金南風、京引119和日本晴等引進品種和魯粳1號、臨稻1號、臨稻2號、魚農(nóng)1號和魯香粳2號等自育品種；2000年至今種植自主選育品種，前期主要種植臨稻10號、臨稻11、圣稻301、香粳9407、陽光200和圣稻13等品種，近年來主要種植圣稻18、圣稻19、臨稻16和潤農(nóng)11等品種。自20世紀90年代以來，山東省培育了一批水稻品種，這些品種無論是從產(chǎn)量還是抗性上，都較以前種植品種有了很大的提高。但目前在水稻育種工作中存在過分倚重核心親本，造成品種遺傳基礎狹窄、同質化現(xiàn)象嚴重。因此，利用遺傳多樣性分析育種材料的遺傳背景和親緣關系，可拓寬水稻親本的遺傳基礎，為合理利用優(yōu)異親本和培育新品種提供幫助，對種質創(chuàng)新和新品種選育具有重要意義。

SSR標記具有簡便、穩(wěn)定、多態(tài)性高和成本低等優(yōu)點，是目前在水稻種質資源遺傳多樣性研究中應用最廣泛的分子標記，已被廣泛應用于評價水稻的遺傳多樣性和親緣關系。應用SSR標記技術對不同來源和年代育成的水稻品種資源進行遺傳多樣性研究的報道很多。趙慶勇等[2]用64對SSR引物對江蘇省育成以及引進的30個粳稻品種進行遺傳多樣性分析，結果表明江蘇省育成的品種遺傳多樣性不夠豐富，多數(shù)品種間親緣關系較近。張燕紅等[3]利用63對引物對新疆維吾爾自治區(qū)育成品種及引進資源進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)育成品種的遺傳背景相似性較高、多樣性不夠豐富。李小華等[4]利用12對SSR引物對浙江省育成的46個常規(guī)粳稻品種進行了遺傳多樣性分析和指紋圖譜構建。劉丹等[5]利用45對SSR引物對黑龍江省不同育種單位育成的粳稻資源進行了遺傳多樣性分析。韓迎春等[6]對河南省粳稻品種進行SSR指紋圖譜構建及遺傳差異分析的研究表明，推廣的品種遺傳基礎較為狹窄。

水稻品種的遺傳多樣性決定著育種的發(fā)展前景[7]。育種工作成效的大小很大程度上取決于所掌握種質材料的數(shù)量及對其性狀表現(xiàn)的深入了解，通過遺傳背景分析可以進一步了解水稻品種間的親緣關系，所以，為培育更多優(yōu)質的水稻新品種，有必要對山東省近年來育成和審定水稻品種的遺傳多樣性進行分析，明確其遺傳差異程度。SSR標記可以進一步了解水稻品種間的遺傳距離和親緣關系，避免僅依據(jù)表型選擇親本，減少育種工作中親本選配的盲目性，從而提高育種效率。

因此，本研究選取山東省近年來審定和育成的48個水稻品種（系），利用48對SSR引物對其進行遺傳多樣性分析，探討品種（系）間的親緣關系及其變化趨勢，為更有效地開展水稻育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取48個自2002年以來通過山東省審定和完成生產(chǎn)試驗的水稻品種（系）及山東省育種單位育成的國審水稻品種（系）作為試驗材料，于2018年種植于山東省水稻研究所濟寧試驗基地。材料的名稱和來源見表1。

表1 供試水稻品種（系）的名稱和來源

1.2 供試SSR引物

所用引物為農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《水稻品種鑒定技術規(guī)程SSR標記法（NY/T 1433-2014）》中公布的48對SSR引物。熒光引物由上海生工生物技術有限公司合成，正向引物加注FAM（藍）的熒光染料。

1.3 基因組DNA的提取、純化和檢測

采用CTAB結合Glass Milk法提取基因組DNA，使用Merinton SMA 1000 Nanodrop分光光度計檢測DNA濃度及純度，保證OD260/OD280值≥1.8，濃度≥20ng/μL，同時分別取2μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA完整性。

1.4 PCR擴增與產(chǎn)物多重熒光檢測

采用25.0μL的PCR擴增反應體系，其中10×PCR Buffer（含2mmol/L Mg2+）2.5μL、2.5mmol/L dNTP 2.0μL、5UDNA聚合酶0.2μL、5μmol/L正反向引物各1.0μL、DNA模板2.0μL和超純水16.3μL。取20μL ROX500內(nèi)標加入980μL去離子甲酰胺中，渦旋混勻，離心，按10μL/孔分裝至新的96孔板內(nèi)，取1～2μL PCR產(chǎn)物對應地加入各孔中，3000轉/min離心1min；于PCR儀上95℃變性5min，立即置于冰上。在ABI 3730XL DNA測序儀上進行熒光毛細管電泳；50cm毛細管，使用POP 7液體分離膠，15kV預電泳18s，待毛細管洗滌完畢后，15kV電泳28min。使用DNA Collection Software軟件收集原始數(shù)據(jù)。引物、熒光標記、DNA聚合酶和dNTP等試劑購自上海生工生物技術有限公司，POP 7液體分離膠購自美國應用生物系統(tǒng)（Applied Biosystems）中國代理公司。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

利用Gene Mapper V3.2進行圖像分析與數(shù)據(jù)收集。利用Power Marker V3.25分析統(tǒng)計每對引物的等位基因數(shù)、基因型數(shù)、等位基因頻率和多態(tài)性信息量（PIC），標記指數(shù)（marker index，MI）按公式MI=Allele×PIC計算，式中Allele為該引物的等位基因數(shù)。應用統(tǒng)計分析軟件NTSYS 2.10[8]以共有片段比例（軟件中coefficient參數(shù)選擇SM）為指標計算材料之間的遺傳相似性系數(shù)（genetic similarity coefficient，GSC）。根據(jù)GSC，通過NTSYS 2.10用非加權類平均法（UPGMA）進行聚類分析，并繪制成樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 SSR標記多態(tài)性分析

結果（表2）表明，所用48對引物中RM71、RM85、RM119、RM267、RM274、RM278、RM424和RM443 8個引物在供試的48個品種（系）中未檢測到多態(tài)性位點；其余40對引物在供試的48個品種（系）中能夠檢測到多態(tài)性位點，占所用引物的83.3%，共檢測到133個等位基因，SSR引物等位基因數(shù)變異范圍為1～7個，平均值為3.32。RM336檢測到的等位基因數(shù)最多，為7個。多態(tài)性信息量（PIC）是等位基因數(shù)和頻率的函數(shù)，具有較高PIC值的SSR標記具有較高的檢測效率，SSR位點的PIC平均值為0.2560，變幅范圍為0.0384～0.7333，RM336的PIC值最高，為0.7333。各SSR引物的MI變化范圍在0.08～5.13，平均值為0.93。

表2 SSR引物、染色體位置、基因多樣性、等位基因數(shù)、PIC值和MI

2.2 48個粳稻品種（系）的遺傳相似性分析

根據(jù)供試引物在48份供試品種（系）中所獲得的133個等位基因，按NTSYS 2.10統(tǒng)計分析軟件計算GSC。48個水稻品種（系）的GSC在0.6390～0.9859之間，平均值為0.7800。其中，臨稻10（臨89-27-1/日本晴）和大糧203（臨稻10/焦選D2）、臨稻10和臨稻23（臨稻10/鹽粳7號）、臨稻23和臨稻21（臨稻10/鎮(zhèn)稻88）、圣稻17（圣稻13/圣稻15）與圣稻20（圣稻13/圣稻15）4組品種（系）間的GSC最大，均為0.9859。根據(jù)系譜來看，大糧203、臨稻21和臨稻23均是以臨稻10號為親本選育而來，圣稻17與圣稻20均是以相同組合選育而來，這些品種（系）的遺傳背景極為相近；圣稻14和臨稻15、圣稻1722與臨稻16 2組品種（系）間的GSC最小，為0.6390。根據(jù)計算所得的1185個GSC，以0.02為組距進行次數(shù)分布分析，由圖1可知，供試材料的GSC次數(shù)呈正態(tài)分布。GSC在0.7189～0.9859之間的數(shù)量為1062個，占整個數(shù)據(jù)的89.6%；0.8189～0.9859之間的有370個，占總數(shù)的31.2%，說明山東省育成的水稻品種（系）間遺傳相似性高，遺傳差異較大的品種（系）數(shù)量少。

圖1 GSC次數(shù)分布

2.3 基于SSR分析的聚類結果

由圖2可知，供試品種（系）在GSC 0.75處可以被區(qū)分為4個類群，類群I包含圣稻20、圣稻17等在內(nèi)的28個品種（系）；類群II包含豐稻4號、陽光958等在內(nèi)的18個品種（系）；類群III和類群IV分別只含有1個品種（系），分別為臨稻20和圣香136。類群I和類群II內(nèi)品種（系）的GSC高，例如臨稻10和大糧203等，GSC達到0.9850，這些品種（系）在田間也表現(xiàn)出一定的相似性，與聚類分析結果相吻合；類群III和類群IV的各1個品種（系）獨立成群，與其他品種（系）的GSC為0.7200左右，說明與其他品種（系）的親緣關系較遠。以上結果表明，山東省近年育成的品種（系）之間整體遺傳相似程度較高，品種（系）資源親緣關系較近，遺傳多樣性較低。

3 討論

3.1 SSR標記

本研究所用的48對SSR引物覆蓋了水稻12條染色體，每條3～5個等位基因。利用所選標記對48個水稻品種（系）進行遺傳多樣性分析，共檢測到133個等位基因，每對引物檢測到1～7個等位基因。李小華等[4]用12對SSR引物分析了46個浙江省粳稻品種的遺傳多樣性，共檢測出84個等位基因，平均7個。張燕紅等[3]用63對引物分析新疆粳稻種質資源，共檢測到388個有效等位基因，平均每對引物6.158個等位基因；何宇涵等[9]用13對引物分析22份河南省粳稻資源共檢測出40個等位基因，每個位點平均3.1個等位基因；徐大勇等[10]用33對多態(tài)性引物在136個粳稻品種中共檢測出106個等位基因，每個位點平均等位基因數(shù)為3.2個；孫健等[11]用42對SSR標記分析黑龍江省主栽品種，檢測到等位基因數(shù)平均為3.31個。本試驗中的40對多態(tài)性引物平均每個位點檢測出等位基因數(shù)為3.32個，該結果與河南省粳稻資源[9]、黃淮稻區(qū)[10]和黑龍江省[11]研究結果相似，但稍低于46個浙江省粳稻品種[4]和新疆種質資源[3]，可能與選取的SSR標記和試驗材料不同有關。供試引物的PIC平均值為0.2560，變幅范圍為0.0384～0.7333，RM336、RM583、RM567和RM209等引物的PIC值較高，這些引物可以用于山東省育成品種的指紋圖譜構建和種子純度的鑒定。

圖2 48個水稻品種（系）的遺傳相似性聚類圖

3.2 供試品種（系）親緣關系

本研究供試品種（系）間的GSC變化范圍在0.6390～0.9850之間，89.6%品種（系）的GSC在0.7189～0.9859之間，表明近年來山東省育成的水稻品種（系）總體上遺傳相似性高，多數(shù)品種（系）間遺傳背景比較單一，大部分品種（系）間的遺傳距離小。不僅是山東省，甚至是全國稻區(qū)都存在品種遺傳基礎不夠廣泛的現(xiàn)象。王勝軍等[12]比較分析了1981-2002年雜交秈稻主要親本，認為其遺傳基礎狹窄、背景單一；楊靜等[13]對黑龍江省育成的及日本引進的54個水稻品種進行遺傳多樣性分析，結果表明絕大多數(shù)供試品種的親緣關系都很近；趙慶勇等[2]、張燕紅等[3]、李小華等[4]、李云海等[14]、肖小余等[15]和蔣曉英等[16]也分別從DNA水平推斷了我國部分雜交稻或者常規(guī)稻品種的遺傳背景比較單一，迄今已利用的遺傳資源的遺傳基礎較狹窄。

根據(jù)樹狀聚類圖，本研究選取的水稻品種（系）主要分為2大類，類群Ⅰ包含圣稻20、圣稻17、圣稻27、臨稻15、臨稻22等28個品種（系），系譜分析表明，這28個品種（系）中大部分是以鎮(zhèn)稻88、臨稻10號等為主要親本直接或者衍生育成的品種（系），類群Ⅱ包含圣稻18、圣稻19、圣稻22、圣稻25、圣稻3466等18個品種（系），其中除陽光600外全部為直穗型品種（系），系譜分析發(fā)現(xiàn)這一大類品種（系）是在圣稻301、鎮(zhèn)稻88等山東省原有主要種植品種（系）基礎上為了改進遺傳基礎狹窄等問題，利用引進的直穗型“太湖粳”育成的一系列品種（系）[17]，其中水稻品種陽光600組合為鎮(zhèn)稻88/旭夢，按系譜來看應該歸為類群Ⅰ中，可能在試驗過程中取錯種子或者葉片造成的。山東省水稻育種目前利用的資源主要來自江蘇省、天津市等相鄰生態(tài)區(qū)，東北粳稻和引進粳稻應用很少且效果不佳，這可能是山東省育成品種（系）遺傳相似性高的主要原因。因此，在今后的育種工作中應注意利用遺傳差異大的資源，如引進秈稻、國外水稻資源等，不斷拓展遺傳基礎，進一步提高品種的產(chǎn)量、品質和抗性。

4 結論

48個山東審定/育成水稻品種（系）的遺傳相似系數(shù)在0.6390～0.9859之間，89.6％的品種（系）遺傳相似系數(shù)在0.7189～0.9859之間，品種（系）的遺傳多樣性不夠豐富，親緣關系較近，在下一步的育種工作中，需進一步拓寬親本選擇范圍，擴大遺傳信息。

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Analysis of Genetic Diversity of Rice Varieties (Lines) in Shandong Province

Zhang Quanfang1, Jiang Mingsong2, Chen Feng2, Zhu Wenyin2,Zhou Xuebiao2, Yang Lianqun1, Xu Jiandi2

(1Institute of Crop Germplasm Resource, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, Shandong, China;2Institute of Wetland Agriculture and Ecology,Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, Shandong, China)

Genetic diversity of 48 rice varieties (lines) in Shandong were analyzed with 48 pairs of SSR primers published in the agricultural industry standard (NY/T 1433-2014) and fluorescent SSR-PCR technology was used in automatic DNA analyzer. The results indicated that a total of 40 pairs of SSR primers performed polymorphism and the polymorphism rate was 83.3%. One hundred and thirty-three alleles were detected with an average of 3.32, ranged from one to seven alleles per locus. The value of PIC ranged from 0.0384 to 0.7333 with an average of 0.2560 per SSR marker. The value of marker index (MI) ranged from 0.08 to 5.13, with an average of 0.93 per SSR marker. The genetic similarity coefficients (GSC) of 48 varieties (lines) ranged from 0.6390 to 0.9859, with an average of 0.7800, and GSCs of 89.6% tested materials ranged from 0.7189 to 0.9859 which showed they had closer genetic relationship. On the basis of GSCs, 48 varieties (lines) were divided into four groups at the threshold of 0.75 by UPGMA method. The results showed that the rice varieties (lines) in Shandong province had closer genetic relationship with each other and the genetic diversity was not enough. It was necessary to explore the genetic resources and enlarge the genetic background in order to increase the yield in current rice breeding.

Rice; SSR markers; Genetic diversity; Cluster analysis

10.16035/j.issn.1001-7283.2021.04.004

張全芳，主要從事作物分子育種研究，E-mail：zhquanfang@163.corn；姜明松為共同第一作者，主要從事水稻遺傳育種研究，E-mail：sds2317831@163.com

徐建第為通信作者，研究方向為水稻遺傳育種，E-mail：xjiandi79@163.com

國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFD010050503）；山東省農(nóng)業(yè)良種工程項目（2019LZGC003）；山東省水稻產(chǎn)業(yè)技術體系項目（SAIT-17-1）；山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目（CXGC2018B04，CXGC2016A11，CXGC2018E16）；水稻生物學國家重點實驗室開放課題（20190204）

2020-08-19；

2020-09-01；

2021-07-26