王炳策 劉曉娟 程斌 任明見 徐如宏 張素勤 張立異 何方

燕麥屬植物核糖體DNA染色體定位及45S rDNA的系統(tǒng)進化分析

王炳策1劉曉娟1程斌2任明見1徐如宏1張素勤1張立異2何方1

（1貴州大學農學院/國家小麥改良中心貴州分中心，550025，貴州貴陽；2貴州省農業(yè)科學院旱糧研究所，550006，貴州貴陽）

由于缺乏明確的二倍體供體信息，燕麥屬植物的起源和系統(tǒng)進化關系一直存在爭議。利用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）方法，檢測45S rDNA和5S rDNA在燕麥屬不同倍性植物染色體上的位點信息；并依據(jù)已公開的45S rDNA ITS區(qū)全長DNA序列構建分子進化樹。探討燕麥屬植物在不同基因組中45S rDNA的位點變化、進化規(guī)律以及分化機制，為探究燕麥屬物種的起源與演化提供參考。

燕麥屬；45S rDNA；熒光原位雜交；ITS

燕麥屬（L.）屬于禾本科（Poaceae Barn.）早熟禾亞科（Pooideae Benth.）燕麥族（Aveneae Dumort.），主要分布在歐洲、非洲、亞洲、澳大利亞、美洲的溫帶和寒帶地區(qū)。我國燕麥主要分布在華北、西北和西南高海拔等干旱、半干旱地區(qū)[1]；其抗逆性強，對土壤的要求低，且耐鹽、耐酸、耐冷、耐旱、耐瘠薄[2-3]。燕麥屬植物具有重要經濟價值，主要是作為糧食作物、保健食品、高級飼料和工業(yè)原料。在世界八大谷類作物中，燕麥屬栽培種（簡稱栽培燕麥）總產量居第6位，僅次于小麥（）、水稻（）、玉米（）、大麥（）和高粱（）。栽培燕麥富含蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素和微量元素等多種營養(yǎng)成分，與人們日常食用的小麥、水稻、玉米、大麥和高粱等作物相比，其籽粒中蛋白質、脂肪、礦物元素、纖維素和維生素五大指標含量均居首位。此外，燕麥粉蛋白質的氨基酸組成比較平衡，其中賴氨酸的含量比小麥等糧食作物高1.5～3.0倍。帶稃型栽培燕麥籽粒蛋白質、粗纖維、粗脂肪、鈣、磷含量高，是馬屬動物的標準飼料。燕麥莖稈是高檔紙的優(yōu)質原料，稃殼可以提取糠醛，是重要的有機化工原料。

燕麥屬是相對古老的作物屬（x=7），關于其分類問題，最早由林奈于1753年按形態(tài)學特征命名了燕麥屬的4個種：普通栽培燕麥（）、野紅燕麥（）、普通野燕麥（）和裸燕麥（）；Malzev于1930年對燕麥進行了詳盡的分類。Kihara（1924）依據(jù)細胞學對燕麥分類進行研究，發(fā)現(xiàn)3個不同的染色體數(shù)14、28和42，依此將研究的10個種分為3個種群：二倍體（2n=14）、四倍體（2n=28）和六倍體（2n=42）種群。董玉琛等[4]總結前人的結果，將燕麥屬27個種按倍性水平分成3個種群，其中二倍體種12個，四倍體種8個，六倍體種7個；按野生種和栽培種分為22個野生種和5個栽培種。其中二倍體燕麥（A、C基因組）主要包括小粒裸燕麥（Vav.）、砂燕麥（Schreb.）、威氏燕麥或沙漠燕麥（Steud.）和短燕麥（Roth.）；四倍體燕麥（AB、AC基因組）主要包括細燕麥（Pott.）和阿比西尼亞燕麥（Hochst.）；六倍體燕麥（ACD基因組）主要包括地中海燕麥（C. koch）、普通野燕麥（L）、普通栽培燕麥（L.）和野紅燕麥（L.）[5]。通過染色體核型、RAPD、醇溶蛋白圖譜研究證實，二倍體物種的A、C基因組是燕麥屬中差異最顯著的2個基因組類型[6]：A基因組包括Ap、Al、Ad、Ac和As 5個亞型，各亞型間的進化關系最復雜[7]；C基因組包括Cm、Cp和Cv 3個亞型，是燕麥屬進化速度最慢的基因組[8-9]。大量研究[10]表明B、D基因組和A基因組有較高的同源性，由于自然界尚未發(fā)現(xiàn)B、D基因組二倍體物種，而且B基因組只存在于四倍體物種，D基因組只存在于六倍體物種，導致有關燕麥的起源演化問題至今還未得出一致的結論。

核糖體DNA基因（ribosomal DNAs，rDNA）是真核生物中一類高度保守的基因家族，具有重要的生物學功能，成簇分布于1對或多對染色體上[11]。高等植物細胞核45S rDNA是串聯(lián)重復序列，由18S rDNA-5.8S rDNA-28S rDNA和基因間的2個內轉錄間隔區(qū)（ITS1和ITS2）組成1個重復單元，其中ITS1-5.8S rDNA-ITS2稱為ITS區(qū)。利用熒光原位雜交（FISH）的方法將45S rDNA在染色體上進行物理定位，不僅可以作為一種染色體標記對植物染色體進行分析和識別，而且可以分析染色體的結構變異和研究種屬之間的進化關系等遺傳學問題[12-14]。同時，在植物分子系統(tǒng)學研究中，由于ITS區(qū)較編碼區(qū)進化速率更快，因此常用于較低分類階元的系統(tǒng)學研究[15]。

在染色體FISH定位分析和系統(tǒng)發(fā)育研究中，已有許多不同物種45S rDNA位點的研究，但關于燕麥屬植物45S rDNA基因，尤其是分子進化的系統(tǒng)分析還較少[16-18]。本研究以5S rDNA和45S rDNA為探針，進行熒光原位雜交（FISH）。檢測其在燕麥屬不同倍性植物染色體上的位置。并依據(jù)已公開的45S rDNA序列構建分子進化樹。探討燕麥屬植物在不同基因組中45S rDNA的位點變化、進化規(guī)律以及分化機制，為探究燕麥屬物種的起源與演化提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

材料為偏凸燕麥（，CvCv）、砂燕麥（A.，AsAs）、裂稃燕麥（，AABB）、葡萄牙野燕麥（var.，AACCDD）、光稃野燕麥（var.，AACCDD）和栽培燕麥16Co1、16Co2（，AACCDD），由貴州大學農學院/國家小麥改良中心貴州分中心保存提供。普通小麥5S rDNA和45S rDNA由山東農業(yè)大學農學院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞學鑒定 種子在室溫條件下浸泡吸脹后腹溝朝下均勻置于濕潤的濾紙上，25℃培養(yǎng)32h以上，待根長2～3cm時取下根尖，經高純度笑氣（N2O）處理2h左右，90%乙酸固定5～10min后，轉移到70%乙醇溶液中保存。將固定好的根尖轉移到纖維素果膠酶中，37℃水浴55～60min后，進行壓片，鏡檢，照相。

1.2.2 質粒DNA的提取 挑取單菌落于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，加抗生素（氨芐，50mg/L），在37℃、200轉/min培養(yǎng)8～12h后，取部分菌液加甘油于-80℃保存?zhèn)溆?，余下菌液用于提取質粒。從測序正確的大腸桿菌中提取質粒，方法參照全式金（北京，全式金生物技術有限公司）Easy PureTM Plasmid MiniPrep Kit試劑盒說明書進行。

1.2.3 FISH分析 將Kato等[13]的方法略作修改。采用缺口平移法，提取的5S rDNA和45S rDNA分別利用Texas red-5-dUTP和Fluorescein-12-dUCP進行標記。每張染色體制片加20μL雜交液，蓋上蓋玻片，55℃保濕下雜交過夜。雜交完成后，揭去蓋玻片，室溫下依次置于2×SSC、2×SSC和ddH2O中各5min，晾干，復染，蓋上蓋玻片，最后通過熒光顯微鏡（OLYMPUS BX-61，日本）進行觀察分析，利用顯微鏡照相機（Nikon DS-Ri1，日本）進行圖像采集。

1.2.4 45S rDNA序列的獲取 在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索燕麥屬45S rDNA序列，手動篩選含有ITS1-5.8S rDNA-ITS2（ITS區(qū)）全長DNA序列的檢索結果，下載到fasta文件，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 數(shù)據(jù)處理

以小麥45S rDNA（Genebank：KP711089.1）的ITS區(qū)序列為外群，與篩選的45S rDNA ITS區(qū)序列通過CLUSTAL_X軟件[19]進行比對之后載入GeneDoc軟件（http://nrbsc.org/gfx/genedoc）進行手工修訂，修訂后的序列通過MEGA X軟件[20]采用最大似然法（maximum likelihood，ML）構建進化樹，bootstrap值設為1000。

2 結果與分析

2.1 燕麥屬植物染色體細胞學鑒定

為獲得FISH適宜的染色體分裂時期，對供試材料的有絲分裂染色體進行了普通細胞學鑒定。結果（圖1）表明，所選根尖細胞染色體均處于有絲分裂中期，且偏凸燕麥、砂燕麥、裂稃燕麥、葡萄牙野燕麥、光稃野燕麥、栽培燕麥16Co1和16Co2的染色體條數(shù)分別為14、14、28、42、42、42、42條，符合各供試材料的倍性水平。

a：偏凸燕麥；b：砂燕麥；c：裂稃燕麥；d：葡萄牙野燕麥；e：光稃野燕麥；f：栽培燕麥16Co2

2.2 5S rDNA和45S rDNA在燕麥屬植物染色體的分布

利用Texas red-5-dUTP標記的45S rDNA（紅色）和Fluorescein-12-dUCP標記的5S rDNA（綠色）為探針對7份燕麥有絲分裂染色體進行FISH分析。

結果（表1和圖2）表明，在砂燕麥和偏凸燕麥有絲分裂中期染色體上45S rDNA分別有2對和3對雜交信號，5S rDNA各有2對和1對雜交信號，這些5S rDNA雜交信號分別和1對45S rDNA雜交信號位于同一條染色體上（圖2a～b）。5S rDNA和45S rDNA在裂稃燕麥分別有3對和2對雜交信號，其中2對5S rDNA位點和1對45S rDNA位點位于同一條染色體（圖2c）。光稃野燕麥（圖2d）和栽培燕麥（16Co1、16Co2）（圖2e～f）有絲分裂中期染色體5S rDNA和45S rDNA雜交信號沒有明顯差異，各呈現(xiàn)3對雜交信號，其中2對染色體上含有5S rDNA和45S rDNA位點，1對染色體上只有45S rDNA位點。

表1 供試燕麥45S rDNA和5S rDNA信號信息

a：砂燕麥；b：偏凸燕麥；c：裂稃燕麥；d：光稃野燕麥；e：栽培燕麥16Co1；f：栽培燕麥16Co2

2.3 45S rDNA ITS區(qū)DNA序列分析

以“internal transcribed spacer AVENA”為檢索條件，在NCBI中檢索獲得341條燕麥屬植物45S rDNA序列。刪除小于400bp的序列，手動篩選含ITS1、5.8S rDNA和ITS2區(qū)域全長的DNA序列，共獲得214條燕麥屬植物45S rDNA ITS全長序列，涵蓋燕麥屬二倍體（AcAc、AdAd、AlAl、AsAs、CpCp、CvCv）、四倍體（CmCmCmCm、AABB、AACC）和六倍體（AACCDD）10種基因組類型。為后續(xù)分析方便，依據(jù)所在基因組和物種的不同，對每條序列進行重命名（表2）。所有DNA序列經CLUSTAL_X比對后，通過GeneDoc軟件手工修訂，保留保守序列，最終每條序列長度約600bp。

表2 公開的含45S rDNA ITS區(qū)DNA序列全長的燕麥屬物種

續(xù)表2 Table 2 (continued)

2.4 系統(tǒng)進化分析

利用最大似然法構建小麥為外群的系統(tǒng)進化樹（圖3），這些序列依據(jù)基因組的差異，可以分為明顯的4支。As基因組沙漠燕麥（）和大西洋燕麥（）的ITS DNA序列的聚在一起（藍色），表明這些序列的“祖先”基因發(fā)生分化的時間較早。其余3個分支，C基因組（綠色）、AB基因組（橙色）和ACD基因組（紅色）的大多數(shù)ITS DNA序列由于基因組的差異能夠分別聚到一起，但各物種不同類型的ITS DNA序列在3個分支中均有分布，且存在于不同的進化支中，不存在單獨分支，說明5個物種的進化模式不存在單獨的特點，而是有同樣的進化模式。

圖3 燕麥屬植物與小麥45S rDNA序列系統(tǒng)進化樹

3 討論

rDNA在染色體上的位點數(shù)目和分布特點可以反映出近緣種屬物種之間的系統(tǒng)進化關系，也能有效地反映種屬間的分化程度。本試驗所用二倍體砂燕麥和偏凸燕麥基因組分別為AsAs和CvCv，裂稃燕麥基因組為AABB，葡萄牙野燕麥、光稃野燕麥和栽培燕麥基因組均為AACCDD。盡管自然界中尚未發(fā)現(xiàn)燕麥屬物種B和D基因組的二倍體供體種，通過對7份燕麥的45S rDNA和5S rDNA位點在染色體上的定位和分布統(tǒng)計，可以推測AABB基因組中45S rDNA位點均來源于A基因組，含有5號雜交信號的染色體來源于B基因組（圖2c）；AACCDD基因組中，含1+4+5號雜交信號的染色體可能來源于A基因組，含2+6號雜交信號的染色體可能來源于D基因組，含有3號雜交信號的染色體可能來源于A基因組或C基因組（圖2d～f）。雖然在物種的進化過程中，rDNA在染色體上的位點可能發(fā)生變化，但這依然可以為查找燕麥屬B和D基因組的二倍體供體種提供參考。同時由于本試驗分析的品種還較少，還需進一步的研究以提供更為詳細的信息。

在植物進化過程中，多倍化是普遍的生物學現(xiàn)象。本研究中燕麥屬物種含有二倍體、四倍體和六倍體3種不同的類型。在多倍化進程中45S rDNA位點數(shù)會隨著染色體的加倍而相應加倍，二倍體、四倍體和六倍體燕麥屬物種的45S rDNA位點數(shù)目應隨著倍性的增加而增多。但本試驗中，二倍體的砂燕麥和四倍體的裂稃燕麥均含有2對45S rDNA位點；六倍體的野燕麥和栽培燕麥含有3對45S rDNA位點。其45S rDNA位點數(shù)并沒有隨著染色體的加倍而等比例加倍，出現(xiàn)了拷貝數(shù)減少信號削弱或者位點數(shù)目丟失等情況，可能是由于植物多倍化之后的二倍化過程中，相對強勢的45S rDNA會抑制較為弱勢物種的45S rDNA基因的表達，導致非表達45S rDNA拷貝數(shù)減少，或同源配對和隨后重組導致的染色體結構變異（如缺失、易位等）造成原始物種45S rDNA位點的丟失。在偃麥屬[21-22]、冰草屬[23]和人參屬[24]中均發(fā)現(xiàn)類似的生物學現(xiàn)象。這些類似基因組沖擊（genomic shock）的適應性變化對新形成多倍體物種基因組的進化和穩(wěn)定發(fā)揮了重要的作用[25]。

45S rDNA ITS在核基因組中的重復單位通過染色體的不等交換和高頻率的基因轉換進行位點內和位點間的致同進化，使不同拷貝的序列趨于基本相近或完全一致。這種特性使ITS序列被廣泛應用于被子植物系統(tǒng)發(fā)育研究[26]。燕麥屬含有29個種，涉及二倍體、四倍體和六倍體種，包括A、B、C和D 4種基因組。二倍體燕麥為A和C基因組2種，四倍體為AB或AC基因組，六倍體燕麥則都為ACD基因組類型。其中B染色體組只存在于四倍體中，而D染色體組只存在于六倍體中。由于燕麥屬植物基因組構成的復雜性，以及多倍體物種整個基因組的重復，致使燕麥屬植物ITS序列致同進化更為復雜。有研究[27-28]表明，由于致同進化不能在不同親本提供的重復單元之間發(fā)生，導致異源多倍體雙親ITS序列都得以保留，或由于定向致同進化導致只有1個親本類型的ITS被固定。本研究中，利用以公開的45S rDNA ITS區(qū)DNA序列構建進化樹，結果顯示來源于相同基因組的大部分序列很好地聚集到一起，說明燕麥屬多倍體45S rDNA ITS受到致同進化的影響，也說明燕麥屬同一倍性的不同物種可能起源于幾種相同的遠源材料。

由于“近乎完美”的致同進化特點，使ITS區(qū)DNA序列為物種的進化提供了非常有用的系統(tǒng)發(fā)育信息。本研究中，ITS基因樹分為明顯的A基因組和C基因組分支。其中，除沙漠燕麥（）和大西洋燕麥（）的As基因組單獨聚在一起外，含A基因組的不同多倍體燕麥屬物種都以較高的支持率和A基因組二倍體聚在一起；而C基因組分支除了含有C基因組的二倍體外，還有六倍體野燕麥（）的部分ITS區(qū)DNA序列拷貝類型。說明燕麥屬物種的A基因組和C基因組具有明顯差異，而且同一倍性的不同燕麥屬物種其二倍體親本來源可能不同。另外，所有六倍體ACD基因組和四倍體AC、AB基因組都聚合在A基因組分支內，沒有發(fā)現(xiàn)B和D基因組的特異分支。這一結果雖然一定程度上反映了A、B和D基因組之間的一致性，但也可能是由于A、B和D基因組間較快的致同進化導致在含B和D基因組的燕麥屬物種中找不到B和D基因組的分支。

4 結論

二倍體的砂燕麥和四倍體的裂稃燕麥均含有2對45S rDNA位點，二倍體的偏凸燕麥和六倍體的野燕麥和栽培燕麥含有3對45S rDNA位點。以“internal transcribed spacer AVENA”為檢索條件，手動篩選獲得214條燕麥屬植物45S rDNA ITS全長序列。涵蓋燕麥屬二倍體（AcAc、AdAd、AlAl、AsAs、CpCp、CvCv）、四倍體（CmCmCmCm、AABB、AACC）和六倍體（AACCDD）10種基因組類型。利用最大似然法構建的ITS基因樹分為明顯的A和C基因組分支，沒有發(fā)現(xiàn)B和D基因組的特異分支。

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Chromosomal Localization of Ribosomal DNA and Phylogenetic Analysis of 45S rDNA in

Wang Bingce1, Liu Xiaojuan1, Cheng Bin2, Ren Mingjian1,Xu Ruhong1, Zhang Suqin1, Zhang Liyi2, He Fang1

(1College of Agriculture, Guizhou University/Guizhou Subcenter of National Wheat Improvement Center,Guiyang 550025, Guizhou, China;2Institute of Upland Crops, Guizhou Academy of Agriculture Sciences, Guiyang 550006, Guizhou, China）

Due to the incomplete information on the diploid donor, the origin and phylogenetic relationship of oats have been controversial. The fluorescence in situ hybridization (FISH) method was used to detect the location information of 45S rDNA and 5S rDNA on the chromosomes of different ploidy plants of. The molecular evolution tree was constructed based on the published full-length DNA sequence of the 45S rDNA ITS region. This paper discussed the locus changes, evolution laws, and differentiation mechanisms of 45S rDNA in different genomes of oats plants and provided references for exploring the origin and evolution of oat species.

L.; 45S rDNA; Fluorescence in situ hybridization; ITS

10.16035/j.issn.1001-7283.2021.04.002

王炳策，主要從事小麥遠緣材料的細胞學研究，E-mail：bingcew0721@163.com；劉曉娟為共同第一作者，主要從事小麥遠緣材料的細胞學研究，E-mail：lxj831508@163.com

何方為通信作者，主要從事小麥遠緣材料的優(yōu)異基因挖掘與應用，E-mail：fhe1@gzu.edu.cn

國家自然科學基金地區(qū)項目“利用Seq-BSA技術準確定位小麥新抗源貴協(xié)3號的抗條銹病基因”（31660393）；貴州省基金重點項目“小麥抗源貴協(xié)3號抗條銹病基因YrGX3的精細定位”（黔科合基礎[2019]450號）；貴州省農業(yè)科學院青年科技基金“小麥貴協(xié)3號抗條銹病基因的細胞學定位分析”（黔農科院青年基金[2018]02號）

2020-08-05；

2021-04-25；

2021-06-29