別梅,孫立臻,王駿,薛霞,劉艷明*

1(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東 濟(jì)南,250101) 2(山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心,山東 濟(jì)南,250101)

色氨酸是人體的必需氨基酸之一,參與機(jī)體蛋白質(zhì)的合成和代謝調(diào)節(jié),它是煙酸、5-羥色胺、褪黑激素等生物活性物質(zhì)的前體物,影響蛋白質(zhì)、糖類和脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝。當(dāng)人體缺乏色氨酸時(shí)會(huì)引起皮膚疾患、玻璃體退化及心肌纖維化等病癥[1]。相較于成人,嬰幼兒時(shí)期生長(zhǎng)發(fā)育迅速,在該時(shí)期色氨酸及其代謝物對(duì)大腦的發(fā)育和對(duì)進(jìn)食-飽足、睡眠-覺醒規(guī)律等神經(jīng)行為的調(diào)節(jié)發(fā)展至關(guān)重要,因此必須保證嬰兒食品中相關(guān)營(yíng)養(yǎng)素的含量和質(zhì)量[2-4]。消化吸收障礙、代謝紊亂或特定疾病狀態(tài)的兒童對(duì)營(yíng)養(yǎng)素或膳食有更為特殊的需求。

嬰幼兒配方乳粉和特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品作為特定人群的食物來(lái)源,其營(yíng)養(yǎng)成分組成在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中都有特殊規(guī)定,對(duì)色氨酸的含量和添加形式都有相關(guān)的要求[5-6],但缺乏相應(yīng)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)。目前,測(cè)定色氨酸的檢測(cè)方法包括分光光度法[7]、電化學(xué)法[8]、氨基酸分析儀法[9]、高效液相色譜法[10-15]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[16]和離子色譜法[17]等,液相色譜方法的特異性和定量準(zhǔn)確性均有優(yōu)勢(shì)。色氨酸多以蛋白質(zhì)的形式存在于樣品中,需水解為游離態(tài)后才能測(cè)定。目前通常采用的堿水解方法需長(zhǎng)時(shí)間在高溫、高濃度堿液條件下進(jìn)行,色氨酸有一定損失,且在不同的基質(zhì)中色氨酸的損失程度不完全一致。

本研究在經(jīng)典堿水解方法的基礎(chǔ)上引入結(jié)構(gòu)與色氨酸相似的內(nèi)標(biāo)物α-甲基色氨酸,以內(nèi)標(biāo)法定量,使同一水解條件同時(shí)適用于嬰幼兒配方乳粉和特殊醫(yī)學(xué)配方嬰幼兒配方食品(乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方和氨基酸配方)中色氨酸含量的準(zhǔn)確測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(C11H12N2O2,CAS號(hào)：73-22-3,純度99.7%),德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；α-甲基-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(C12H14N2O2,CAS號(hào)：110 117-83-4,純度98%),上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；甲醇(色譜純),美國(guó)Merck公司；醋酸銨(色譜純)、乙酸(色譜純),美國(guó)Fisher Chemical公司；LiOH(分析純)、鹽酸(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚四氟乙烯材質(zhì)水解管,帶螺紋口外蓋,內(nèi)襯聚四氟乙烯密封墊；水相微孔濾膜(0.22 μm),上海安譜；NIST配方乳粉質(zhì)控樣1849a[(184±10)mg/100 g,k=2]、NIST配方乳粉質(zhì)控樣1869[(228±24)mg/100 g,k=2]、嬰幼兒配方乳粉和特殊醫(yī)學(xué)配方嬰幼兒食品(乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方和氨基酸配方),均為市售。實(shí)驗(yàn)室用水符合 GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水要求。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)：準(zhǔn)確稱取10.0 mg色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品用水溶解后定容至100 mL；內(nèi)標(biāo)工作液(1 mg/mL)：稱取10 mg α-甲基-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品用水溶解后定容至10 mL。

1.3 儀器與設(shè)備

Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀配有熒光檢測(cè)器,美國(guó)Thermo Fisher公司；KQ-800DE超聲清洗儀,寧波新芝生物科技股份有限公司；MS204TS電子天平,瑞士梅特勒公司；DHG-9243BS-Ⅲ電熱干燥箱,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；MS 3 basic渦旋混合器,德國(guó)IKA公司；IQ 7000超純水儀,美國(guó) Millipore 公司。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取混合均勻的固體試樣200 mg(精確到1 mg)于配有密封墊的具塞螺紋口聚四氟乙烯離心管中,依次加入0.5 mL內(nèi)標(biāo)工作液、5 mL LiOH溶液(4 mol/L),渦旋混勻后于超聲波振蕩器中振蕩5 min,保證樣品完全溶解后,置于110 ℃烘箱中水解20 h。取出水解管,待冷卻至室溫后,用HCl溶液(4 mol/L)調(diào)pH值至3～8,將水解液全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中并用水定容,混勻后經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過(guò)濾備用。

1.5 儀器條件

色譜柱：Xbridge C18(3.5 μm,150 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相A:乙酸銨溶液(10 mmol/L,pH 4.0);流動(dòng)相B:甲醇;梯度洗脫,洗脫程序見表1；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積5 μL；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)280 nm,發(fā)射波長(zhǎng)346 nm。每次進(jìn)樣前初始流動(dòng)相比例平衡5 min。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器測(cè)定條件的選擇和優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)器的選擇

色氨酸由于其特殊結(jié)構(gòu),既具有紫外吸收,又具有熒光響應(yīng)。為使色氨酸的檢測(cè)能夠獲得較高的靈敏度,需要確定色氨酸的最大吸收波長(zhǎng),最佳激發(fā)波長(zhǎng)與最佳發(fā)射波長(zhǎng)。研究中首先通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器(diode array detector,DAD)將色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長(zhǎng)190～450 nm進(jìn)行掃描,結(jié)果表明,在檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm處,色氨酸有明顯的特征吸收峰,且基質(zhì)干擾較少,故將吸收波長(zhǎng)280 nm作為紫外檢測(cè)器檢測(cè)色氨酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。同時(shí)將最大吸收波長(zhǎng)280 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)通過(guò)熒光檢測(cè)器對(duì)色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行發(fā)射光譜掃描,觀察到色氨酸在波長(zhǎng)346 nm處具有較高的靈敏度。因此,實(shí)驗(yàn)最終確定熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為346 nm。

經(jīng)大量樣本檢測(cè)表明,在相同流動(dòng)相條件下,部分樣品的紫外色譜圖中在目標(biāo)物的保留時(shí)間處有難以分離的干擾峰,并影響到定量結(jié)果的準(zhǔn)確性,故采用熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)和定量。樣品紫外檢測(cè)器譜圖和熒光檢測(cè)器譜圖見圖1。

圖1 樣品紫外檢測(cè)器與熒光檢測(cè)器譜圖比較Fig.1 Comparison of spectrogram between UV detector and fluorescence detector

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相比較了體積分?jǐn)?shù)0.1%的乙酸-甲醇溶液和10 mmol/L 醋酸銨溶液(pH 4.0)-甲醇體系的洗脫情況,結(jié)果表明在0.1%的乙酸溶液條件下個(gè)別樣品中有明顯的干擾峰,且難以與目標(biāo)物有效分離,導(dǎo)致定量結(jié)果不夠準(zhǔn)確。而在10 mmol/L 醋酸銨溶液(pH 4.0)條件下目標(biāo)峰和內(nèi)標(biāo)峰均可以與干擾峰(圖2,峰3)達(dá)到基線分離。譜圖見圖2。

a-甲醇-0.1%乙酸溶液；b-甲醇-醋酸銨溶液圖2 梯度洗脫的色譜圖(pH 4.0)Fig.2 Chromatogram of gradient elution (pH 4.0)

2.2 試樣前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 堿的選擇

在樣品堿水解的過(guò)程中,考察不同的堿對(duì)水解結(jié)果的影響。本研究中,選擇蛋白質(zhì)含量最高的乳粉基質(zhì)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,選取了相同濃度(4 mol/L)的LiOH、NaOH和KOH 3種堿溶液在相同試驗(yàn)條件下進(jìn)行試驗(yàn),考察堿水解后色氨酸含量的變化,結(jié)果見圖3。結(jié)果表明,在相同的條件下,使用LiOH溶液處理的樣品中色氨酸含量最高,使用外標(biāo)法定量回收率為83%,而NaOH溶液和KOH溶液對(duì)試樣中的色氨酸有不同程度地破壞,回收率只有76%和70%,故方法選定LiOH溶液作為水解過(guò)程中的堿溶液。

圖3 不同堿對(duì)色氨酸含量測(cè)定的影響Fig.3 Effect of different bases on the determination of tryptophan content

2.2.2 堿溶液濃度和水解時(shí)間的選擇

以NIST 1849a配方乳粉質(zhì)控樣作為研究對(duì)象,使用2、3和4 mol/L 3種濃度的LiOH溶液分別水解18、20和22 h,測(cè)定的色氨酸含量如圖4所示。由圖4可知,2和3 mol/L堿溶液經(jīng)22 h仍沒有水解完全,而4 mol/L的LiOH在18 h已經(jīng)水解完全,繼續(xù)水解20和22 h沒有明顯變化,為了保證充分的水解,以準(zhǔn)確測(cè)定總色氨酸的含量,選擇4 mol/L LiOH水解溶液、20 h作為最佳的水解條件

圖4 不同濃度堿溶液和不同水解時(shí)間對(duì)色氨酸水解的影響Fig.4 Effect of different concentration of alkali solutions and different hydrolysis time on tryptophan hydrolysis

2.2.3 水解溫度的確定

為考察水解溫度的影響,設(shè)計(jì)了100、110、120 ℃ 3個(gè)水解溫度進(jìn)行考察,結(jié)果見圖5。110和120 ℃水解結(jié)果在18和20 h的時(shí)候無(wú)顯著差異,但120 ℃在22 h以后出現(xiàn)了明顯的下降；而在100 ℃條件下,樣品水解至22 h依然未能水解完全,且增加反應(yīng)時(shí)間后,色氨酸濃度反而出現(xiàn)了下降,通過(guò)色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的堿水解實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)水解時(shí)間過(guò)長(zhǎng),游離色氨酸會(huì)部分被破壞,故本方法選擇110 ℃作為水解溫度。

圖5 不同溫度對(duì)色氨酸水解的影響Fig.5 Effect of different temperatures on tryptophan hydrolysis

2.2.4 堿水解法內(nèi)標(biāo)確定

由于堿水解過(guò)程溫度高,時(shí)間長(zhǎng),對(duì)不同的樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)色氨酸長(zhǎng)時(shí)間在高溫高濃度的堿中會(huì)有一定程度的損失,而且不同基質(zhì)中色氨酸的損失不同。試驗(yàn)增加了在堿水解過(guò)程中充氮保護(hù)的措施,結(jié)果表明,色氨酸的損失在充入氮?dú)獗Ｗo(hù)后略有改善,但使用充氮保護(hù)下堿水解的方法測(cè)試質(zhì)控樣NIST1849a,結(jié)果僅為168 mg/100 g,不能得到滿意的結(jié)果；參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15400—2018 《飼料中色氨酸的測(cè)定》在水解前對(duì)樣品進(jìn)行除脂,試驗(yàn)結(jié)果表明除脂僅對(duì)水解液的外觀有所改變,對(duì)測(cè)定結(jié)果沒有改善。因此在優(yōu)化前處理方法無(wú)法有效降低色氨酸損失的前提下,采用色氨酸的結(jié)構(gòu)類似物作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行同步校正,提高定量準(zhǔn)確性的同時(shí)簡(jiǎn)化樣品處理步驟。本方法將5-甲基-色氨酸和α-甲基-色氨酸作為研究對(duì)象來(lái)考察其作為內(nèi)標(biāo)物定量堿水解方法測(cè)定色氨酸含量的可行性。

先后選擇了NIST質(zhì)控樣1849a和1869作為研究對(duì)象,分別加入5-甲基-色氨酸和α-甲基-色氨酸內(nèi)標(biāo)后進(jìn)行堿水解。不同定量方式和不同內(nèi)標(biāo)的定量結(jié)果顯示(表2),相同條件下以α-甲基-色氨酸作為內(nèi)標(biāo)得到的2個(gè)質(zhì)控樣的含量均能滿足明示的范圍,而5-甲基-色氨酸作為內(nèi)標(biāo)得到的結(jié)果偏高,外標(biāo)法定量的結(jié)果則達(dá)不到質(zhì)控樣的明示下限。以α-甲基-色氨酸作為內(nèi)標(biāo)來(lái)定量能得到更為準(zhǔn)確的結(jié)果。

表2 不同定量方式和不同內(nèi)標(biāo)的定量結(jié)果Table 2 Quantitative results of different quantitative methods and internal standards

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍和定量限

準(zhǔn)確吸取色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)20、100和500、1 000、2 000和5 000 μL于10 mL容量瓶中,加入100 μL內(nèi)標(biāo)(1 mg/mL)工作液,用水定容至刻度,混勻后得到質(zhì)量濃度分別為0.2、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,分別將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液按照濃度由低到高的順序注入液相色譜儀中,測(cè)得相應(yīng)色譜峰的峰面積,以系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo),以目標(biāo)化合物的峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。相關(guān)系數(shù)r>0.999,覆蓋方法定量限和常見樣品的含量水平,線性良好。將S/N>10且能準(zhǔn)確定量的最低濃度點(diǎn)計(jì)算出的含量確定為方法的定量限。結(jié)果見表3。

表3 方法線性方程和定量限Table 3 Linear equation and limit of quantitation of the method

2.3.2 方法準(zhǔn)確度和精密度

試驗(yàn)選取代表性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),樣品分別為嬰幼兒配方乳粉、乳蛋白部分水解樣品和氨基酸配方樣品,對(duì)樣品進(jìn)行平行試驗(yàn)得出本底值后再對(duì)每個(gè)樣品做0.5、1和2倍本底值水平的加標(biāo)試驗(yàn),以回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度和精密度。試驗(yàn)樣品回收率和RSD見表4。樣品的平均回收率在92.5%～97.4%之間,RSD均<3.11%。將試驗(yàn)樣品選取4家機(jī)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)室間RSD<6.7%,顯示了良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表4 不同樣品的回收率及精密度(n=6)Table 4 Recoveries and RSDs of different samples

2.3.3 實(shí)際樣品應(yīng)用

采用本研究建立的方法對(duì)21個(gè)不同種類樣品進(jìn)行測(cè)定。樣品包括不同品牌嬰幼兒配方乳粉8個(gè)、乳蛋白部分水解配方食品4個(gè)、乳蛋白深度水解配方食品4個(gè)和氨基酸配方食品5個(gè)。樣品中色氨酸含量為170～315 mg/100 g,回收率92%～98%,均符合GB 10765—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰兒配方食品》中對(duì)色氨酸含量的要求。

3 結(jié)論

本研究以α-甲基-色氨酸為內(nèi)標(biāo)物,采用堿水解-高效液相色譜法測(cè)定了乳粉及特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中的色氨酸含量。內(nèi)標(biāo)法較好地校正了水解過(guò)程中高溫、高濃度堿溶液和不同基質(zhì)在處理過(guò)程中對(duì)色氨酸的影響,同時(shí)省略了前處理過(guò)程中充氮?dú)獗Ｗo(hù)等步驟,對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,也能得到滿意的準(zhǔn)確度和精密度。應(yīng)用于不同種類的樣品和質(zhì)控樣中目標(biāo)物的測(cè)定均符合明示值,表明該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好,適用于乳粉及特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中色氨酸的準(zhǔn)確定性定量分析,可為企業(yè)生產(chǎn)和有關(guān)部門監(jiān)管提供理論支撐。