賈聰,孟醒,游靜,孫強*,蘆鑫,高錦鴻,黃紀念,2

1(河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心,河南 鄭州,450002) 2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料加工重點實驗室,湖北 武漢,430062)

高血壓是冠心病、動脈硬化、腦卒中、心力衰竭的主要發(fā)病因素。根據(jù)流行疾病學研究,現(xiàn)在有超過10億人患有高血壓,因此高血壓的預防和治療已成為全球亟待解決的公共問題[1]。血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶(angiotensin I-converting enzyme,ACE)是一種二肽羧肽酶,對血壓調(diào)節(jié)起重要作用。目前治療高血壓的藥物以血管緊張素受體拮抗劑(沙坦類)與鈣通道阻滯劑(地平類)為主,但這些化學合成藥物常會引發(fā)咳嗽、皮疹、頭疼等副作用[2]。食源性ACE抑制肽具有毒副作用小、作用平緩兼具有其他有益的生理作用功能[3]。因此利用天然、安全食源性蛋白制備的ACE抑制肽作為化學藥物替代品成為研究熱點[4]。

芝麻是我國重要的油料作物,制油后的副產(chǎn)物—芝麻餅粕主要成分為蛋白質(zhì)(含量約50%),可以作為活性肽的重要來源[5]。研究證實芝麻蛋白通過酶解可以產(chǎn)生ACE抑制肽[6-8]。有學者通過對蛋白酶篩選發(fā)現(xiàn),利用堿性蛋白酶(alcalase)酶解蛋白制備的ACE抑制肽活性較高[6,9]。alcalase由多種蛋白酶復合而成,水解能力強,水解產(chǎn)物以短肽為主,其他蛋白酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶等的酶解專一性較強,只能酶解蛋白質(zhì)上的特定肽鍵,如胰蛋白酶酶切位點主要是C端的Arg和Lys,水解效果較弱。受限于靶標分子(ACE)活性位點的空阻影響,短肽較長肽更容易進入ACE的活性口袋,從而顯示出較高的ACE抑制活性[10]。但alcalase屬于外切蛋白酶,制備的ACE抑制肽由于疏水基團的暴露,往往產(chǎn)生苦味,從而限制了其在食品領域的應用[11]。風味蛋白酶(flavourzyme)是一種風味修飾酶,以疏水性專一的外切蛋白酶為主[12],可有效降低大豆[13]、玉米[14]、鮭魚蛋白酶解液[15]的苦味。然而,目前采用flavourzyme修飾活性肽風味的報道較少,且較少討論風味修飾后對活性及結(jié)構(gòu)特性影響的研究。

因此,本研究利用alcalase和flavourzyme兩步水解芝麻粕蛋白,對產(chǎn)生的 ACE抑制肽進行活性、苦味評價及氨基酸分析,最后采用液相-二級質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS)技術解析芝麻ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)特性,以期為以后芝麻來源的高活性、低苦味降壓肽的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

芝麻粕：實驗室自制,芝麻經(jīng)亞臨界脫油后獲得,其基本組成見表1。Alcalase(235 000 U/mL)、flavourzyme(19 000 U/mL),諾維信(中國)投資有限公司；Na2HPO4、NaH2PO4、三氯乙酸,均為分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司；馬尿酰組氨酰亮氨酸(hippuryl-His-Leu,HHL)、ACE、鄰苯二甲醛(o-phthaldialdehyde,OPA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT),Sigma公司。

表1 芝麻粕基本成分組成 單位：%

1.1.2 儀器與設備

RRHP-350型粉碎機,上海頂帥電器有限公司；Cary Eclipse型熒光光度計,安捷倫科技(中國)有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,鞏義市予華儀器有限責任公司；DL-5-B型離心機,上海安亭科學儀器廠；DELTA 320型pH計,上海梅特勒-托利多儀器有限公司；TestcellC-70型平膜裝置,美國Millipore公司；電噴霧組合型離子阱Orbitrap質(zhì)譜儀,美國Thermo Fisher Scientific公司；K-05型自動定氮儀,上海晟聲自動化分析儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 芝麻粕的酶解反應

參考袁東振等[6]的方法,對芝麻粕進行酶解反應。將芝麻粕粉碎并過100目篩,收集篩下物并均勻分散在0.05 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH 8.2)中,料液比為1∶10(g∶mL),將分散液在沸水浴中加熱10 min后進行酶解反應。

(1)研究alcalase加入量(3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、9 000、10 000 U/g 蛋白)對多肽得率以及ACE抑制活性的影響,反應溫度55 ℃,反應時間180 min。

(2)固定alcalase添加量,研究flavourzyme加入量(1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g蛋白)對多肽得率以及ACE抑制活性的影響,反應溫度55 ℃,反應時間180 min。

(3)固定alcalase和flavourzyme添加量,研究flavourzyme加入時間(alcalase反應0、30、60、90、120、150 min)對多肽得率以及ACE抑制活性的影響,反應溫度55 ℃,反應時間180 min。

酶解反應結(jié)束后迅速放入沸水浴中滅酶10 min,然后在5 000 r/min下離心20 min,取上清液備用。

1.2.2 多肽得率測定

將1 mL酶解液和2 mL 100 g/L的三氯乙酸在漩渦混合儀上混合均勻,然后在8 000 r/min下離心20 min,取上清液并用凱式定氮法測定其中的多肽含量。多肽得率的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：m1,酶解液中的多肽質(zhì)量,g；m0,未酶解原液中的蛋白質(zhì)量,g。

1.2.3 ACE活性抑制率的測定

參照LI等[16]的方法并略有改動。將酶解液進行適當稀釋(肽質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL),并使用96孔酶標板作為反應容器。取15 μL稀釋液(對照液以蒸餾水代替)和30 μL 4.66 mmol/L HHL[0.05 mol/L pH 8.3的硼酸鹽緩沖液(含0.3 mol/L NaCl)配制]混合,隨后加入30 μL ACE(12.5 mU/mL),置于37 ℃恒溫箱中1 h,反應結(jié)束后加入125 μL 1.2 mol/L NaOH溶液終止酶反應。接著加入20 μL 20 g/L的OPA,混合均勻并在室溫下放置20 min,用6 mol/L的HCl溶液(30 μL)終止衍生反應。反應液稀釋10倍后測定熒光吸收強度,激發(fā)波長340 nm,發(fā)射波長455 nm,狹縫寬度5 nm。ACE活性抑制率的計算見公式(2)。將酶解液稀釋不同倍數(shù),以多肽濃度的對數(shù)值為橫坐標,ACE活性抑制率為縱坐標,繪制回歸直線,計算抑制率達到50%時抑制肽的濃度(即半抑制濃度),記為IC50值。

(2)

式中：a,抑制劑與ACE都存在時的熒光吸收強度；b,抑制劑不存在而ACE存在時的熒光吸收強度；c,抑制劑存在而ACE不存在時的熒光吸收強度；d,抑制劑與ACE都不存在時的熒光吸收強度。

1.2.4 氨基酸組成分析

氨基酸測定方法參照GB/T 18246—2000。游離氨基酸測定采用HPLC法,樣品酸水解后加入氟苯進行衍生反應,然后色譜分析游離氨基酸組成。色譜檢測條件：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相A為0.05 mol/L乙酸鈉,流動相B為體積分數(shù)50%乙腈水溶液,流速為1.2 mL/min,溫度25 ℃,檢測波長為360 nm。

1.2.5 苦味評價

參照HOMFMANN[17]的方法略有修改,取1 mL樣品(肽質(zhì)量濃度為5 mg/mL)至燒杯中,添加蒸餾水逐步稀釋,直至嘗不出苦味為止,記錄加水量即為稀釋倍數(shù)。稀釋倍數(shù)越大,說明樣品液苦味越顯著。

1.2.6 ACE肽序列鑒定和合成

樣品經(jīng)自填脫鹽柱脫鹽后,采用反相高效液相色譜(reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)進行分離純化。色譜條件：C18色譜柱(150 μm×150 mm,1.9 μm)；流動相A為體積分數(shù)0.1%甲酸和2%乙腈水溶液,流動相B為體積分數(shù)0.1%甲酸和80%乙腈水溶液；流速600 nL/min。梯度洗脫條件為0～20 min,6%～14% B；20～50 min,14%～30% B；50～60 min,30%～95% B。

利用電噴霧組合型離子阱Orbitrap質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。一級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率70 000,AGC目標為3×106,最大IT為40 ms,掃描范圍300～1 400m/z；二級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率17 500,AGC目標為1×105,最大IT為60 ms,TopN為20,NCE/steppedNCE為27。

為驗證質(zhì)譜鑒定的多肽活性,將選擇的多肽進行固態(tài)化學合成(無錫亞肽公司),純度>95%,然后溶于去離子水中,稀釋不同濃度梯度,測定其IC50值。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復3次,數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標準方差表示。質(zhì)譜解析多肽序列采用Denovo的方法。數(shù)據(jù)顯著性分析采用SPSS Statistics20軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 alcalase/flavourzyme兩步水解芝麻粕制備ACE抑制肽

2.1.1 alcalase添加量對多肽得率和ACE活性抑制率的影響

從圖1可以看出,隨著alcalase添加量的增加,多肽得率不斷增加,當添加量高于9 000 U/g 蛋白時,多肽得率略有下降,這可能是因為當alcalase添加量較高時,水解程度加深造成多肽發(fā)生部分水解,生成游離氨基酸,導致多肽得率降低[18]。Alcalase單獨酶解后多肽得率最高為63.43%。由圖1可知,alcalase水解后的ACE抑制活性與多肽得率的變化趨勢較類似,即隨著alcalase添加量的增加,ACE抑制活性逐漸增強,在alcalase添加量為9 000 U/g 蛋白時,ACE抑制活性最高(78.92%),繼續(xù)增加酶量會使具有ACE抑制活性多肽發(fā)生降解,ACE活性抑制率減小。

圖1 Alcalase添加量對多肽得率和ACE活性抑制率的影響Fig.1 Effect of alcalase addition on peptide yield and ACE activity inhibition rate

2.1.2 flavourzyme添加量對多肽得率和ACE活性抑制率的影響

固定alcalase添加量為9 000 U/g 蛋白,在alcalase水解芝麻粕的基礎上,研究flavourzyme添加量對多肽得率和ACE活性抑制率的影響規(guī)律。當flavourzyme添加量<4 000 U/g 蛋白時,多肽得率和ACE抑制率(圖2)隨著flavourzyme添加量的增加而略有增加。Alcalase屬于內(nèi)切蛋白酶,flavourzyme則以外切蛋白酶為主,雙酶水解增加了蛋白的酶切位點,得到更多的活性肽,因此表現(xiàn)更高的ACE抑制活性；當flavourzyme添加量>4 000 U/g 蛋白,多肽得率和ACE抑制活性明顯降低,說明較多的氨基酸殘基被解離出來,多肽的ACE抑制活性可能被破壞。

圖2 flavourzyme添加量對多肽得率和ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of flavourzyme addition on peptide yield and ACE activity inhibition rate

2.1.3 flavourzyme添加時間對多肽得率和ACE活性抑制率的影響

固定alcalase添加量為9 000 U/g 蛋白,flavourzyme添加量為4 000 U/g 蛋白,考察flavourzyme添加時間對多肽得率和ACE活性抑制率的影響規(guī)律。從圖3可知,隨著flavourzyme添加時間的推遲,多肽得率和ACE抑制率呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢,在alcalase酶解60 min后加入flavourzyme,反應結(jié)束后的多肽得率及ACE抑制率較高。這可能是由于alcalase酶解一定時間后蛋白分子結(jié)構(gòu)舒展,暴露更多的肽鍵,有利于flavourzyme充分水解,而超過60 min后加入flavourzyme,由于flavourzyme酶解時間的縮短從而造成多肽得率及ACE抑制率降低。由以上研究可知,在最佳酶解條件下,與單獨的alcalase酶解相比,alcalase/flavourzyme兩步水解后的多肽得率(77.88%)和ACE抑制率(88.10%)明顯提高。

圖3 Flavourzyme添加時間對多肽得率和ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of flavourzyme addition time on peptide yield and ACE activity inhibition rate

2.2 ACE抑制肽的活性分析及苦味評價

活性肽是一類相對分子質(zhì)量<10 kDa的多肽[19],將芝麻粕酶解液依次通過截留分子質(zhì)量不同的超濾膜,分別收集3 k～10 kDa和<3 kDa組分,測定各組分中的多肽量,計算相對百分含量和IC50值,如表2所示。與單獨alcalase水解相比,alcalase/flavourzyme兩步水解后生成的3 k～10 kDa多肽減少,而<3 kDa的小分子肽比例由66.96%增加至82.70%,且3 k～10 kDa和<3 kDa 2個組分均表現(xiàn)出較高的ACE抑制活性(3 k～10 kDa組分：IC50值由1.305 mg/mL降低為0.723 mg/mL；<3 kDa組分：IC50值由0.254 mg/mL降低為0.181 mg/mL)。從表2也可以看出,<3 kDa組分的IC50值低于3 k～10 kDa組分的IC50值,且alcalase/flavourzyme兩步水解后<3 kDa組分表現(xiàn)出最低的IC50值,說明高活性ACE抑制肽的分子質(zhì)量主要集中于3 kDa以下,與WANG等[5]的研究結(jié)果一致。

表2 不同相對分子質(zhì)量ACE抑制肽的相對含量、 IC50值及苦味評價Table 2 Relative content,IC50 values and bitterness evaluation of ACE inhibitory peptides with different molecular weights

另外,結(jié)合苦味評價結(jié)果可知,添加flavourzyme前后,3 k～10 kDa ACE抑制肽基本無苦味(稀釋倍數(shù)均為0.1),但<3 kDa組分的稀釋倍數(shù)由5.4減少為0.4,說明flavourzyme的添加有效降低了高活性ACE抑制肽的苦味強度。

2.3 ACE抑制肽的氨基酸組成

由表3可知,alcalase和alcalase/flavourzyme水解后收集的3 k～10 kDa和<3 kDa組分,氨基酸組成均較全面(除未檢測的色氨酸),含量較高的氨基酸為Glu,是重要的健腦物質(zhì),具有較高的營養(yǎng)價值。與alcalase單獨水解相比,alcalase/flavourzyme兩步水解后3 k～10 kDa組分的必需氨基酸含量略有下降,而<3 kDa組分的必需氨基酸含量明顯增加。依據(jù)FAO/WHO提出的理想模式,必需氨基酸含量為40%左右且必需/非必需氨基酸的比值大于60%,蛋白質(zhì)的質(zhì)量較好[20],由此可見,alcalase/flavourzyme水解后的高活性ACE抑制肽接近理想模式(必需氨基酸含量為42.89%,必需/非必需氨基酸比值為75.10%)。alcalalse水解后游離氨基酸含量較高的為Glu和Cys,而alcalase/flavourzyme水解后這2種氨基酸比例明顯下降,表明flavourzyme添加后游離氨基酸總量增加。與alcalalse水解相比,alcalase/flavourzyme水解后苦味游離氨基酸增加(由28.00%增加至57.24%),但結(jié)合表2的苦味評價,alcalase/flavourzyme水解后的苦味強度低于單獨alcalalse酶解,進一步證實了在alcalalse基礎上添加flavourzyme水解后產(chǎn)生的肽段苦味較低。

表3 不同相對分子質(zhì)量ACE抑制肽的氨基酸組成 單位：%

2.4 ACE抑制肽(<3 kDa)的結(jié)構(gòu)鑒定

單獨alcalase酶解和alcalase/flavourzyme兩步水解后分子質(zhì)量<3 kDa的組分,通過LC-MS/MS分析鑒定的多肽分別有246和223個,其組成如圖4所示,alcalase和alcalase/flavourzyme水解后產(chǎn)生多肽(<3 kDa)的氨基酸數(shù)量為4～11個,其中四肽和五肽的含量較高。與alcalase水解相比,alcalase/flavourzyme兩步水解后的四肽含量由54.88%增加至75.34%,五肽含量由30.89%下降至11.66%,說明flavourzyme能將較多的五肽進一步水解生成四肽。

將以上2種方式水解后鑒定的肽,按可信度評分高低進行排序,并依次與BIOPEP數(shù)據(jù)庫(http://www.uwm.edu.pl/bioche mia/index.php/en/biopep)中已知的ACE肽結(jié)構(gòu)序列進行比對[21],分別篩選出前10條潛在ACE抑制肽進行分析。從表4可知,與alcalase單獨酶解后的肽段分子質(zhì)量(468～776 Da)相比,alcalase/flavourzyme兩步水解的肽段分子質(zhì)量(398～529 Da)較小。ONDETTI等[22]研究發(fā)現(xiàn)活性肽C端的3個氨基酸序列對ACE抑制能力影響較大,綜合比較alcalase和alcalase/flavourzyme水解后肽段序列(表4),發(fā)現(xiàn)有5對短肽結(jié)構(gòu)較類似,分別是KLPLL和APLL、TLPVL和LPVL、HWAY和LPAY、LLPY和LGPY、KFPL和LGPL。而對于結(jié)構(gòu)差異較大的其余短肽,alcalase/flavourzyme兩步酶解后的肽段有2條C端氨基酸殘基為Leu、1條C端氨基酸殘基為Tyr、1條C端氨基酸殘基為Ala和1條C端氨基酸殘基為Ser。活性肽C末端氨基酸殘基為Leu、Tyr、Pro、Trp和Phe時常具有較強的ACE抑制活性[23-24],因此可推測經(jīng)alcalase/flavourzyme兩步水解制備的ACE抑制肽活性較高,與測定的分子質(zhì)量<3 kDa肽段的IC50值(alcalase：0.254 mg/mL；alcalase/flavourzyme：0.181 mg/mL)結(jié)果一致。對結(jié)構(gòu)差異較大的10條多肽進行固態(tài)化學合成,并測定其IC50值,如表4所示,alcalase/flavourzyme兩步酶解后產(chǎn)生的WGGL、LPSL和LPGGY的IC50值較低,分別為 0.004、0.001和0.006 mg/mL,表明這3種氨基酸序列對ACE抑制活性的提高有重要作用。

a-alcalase；b-alcalse/flavourzyme圖4 Alcalase和alcalase/flavourzyme水解后的多肽(<3 kDa)組成Fig.4 Composition of peptides(<3 kDa) prepared by alcalase hydrolysis and alcalase/flavourzyme two-step hydrolysis

表4 Alcalase水解和alcalase/flavourzyme 兩步水解制備的ACE抑制肽(<3 kDa)序列分析Table 4 Sequence analysis of ACE inhibitory peptides(<3 kDa) prepared by alcalase hydrolysis and alcalase/flavourzyme two-step hydrolysis

3 結(jié)論

利用alcalase/flavourzyme兩步水解相比alcalalse單獨酶解芝麻餅粕蛋白后的多肽得率及ACE活性明顯提高。高活性芝麻ACE抑制肽的分子質(zhì)量<3 kDa,營養(yǎng)價值較高且苦味較低。鑒定的10條ACE抑制肽的分子質(zhì)量范圍為398～529 Da,其中氨基酸序列為WGGL、LPSL和LPGGY對ACE抑制活性提高有主要貢獻作用,可用于功能性食品的開發(fā)。然而由于實驗的局限性,后續(xù)研究有待深入分析高活性、低苦味芝麻ACE抑制肽的構(gòu)效關系,為芝麻降壓肽的應用推廣提供理論指導。