魯金佩,丁可盈,郭雯雯,馬瑙,樓喬明,楊文鴿,黃濤

(寧波大學 食品與藥學學院,浙江 寧波,315832)

明膠是膠原蛋白部分水解后的產(chǎn)物,是一種重要的生物聚合物,因其具有凝膠性、增稠性、乳化性、成膜性等多種功能特性,被廣泛應用于食品、醫(yī)藥和攝影等行業(yè)[1]。目前,全球98.5%的商業(yè)明膠來源于哺乳動物,但受到口蹄疫、瘋牛病和非洲豬瘟等哺乳動物疾病的影響,其食用安全性備受質(zhì)疑；此外,社會文化和宗教信仰等原因也使哺乳動物明膠的應用市場受到了限制[2]。因此,開發(fā)可替代哺乳動物明膠的新型明膠原料成為明膠領(lǐng)域研究的熱點和難點之一。

魚明膠(fish gelatin,FG)是從魚類加工副產(chǎn)物(魚鱗、魚皮、魚骨和魚鰾)中提取的膠原蛋白水解產(chǎn)物,因其具有類似哺乳動物明膠的多功能物理特性,被認為是一種潛在優(yōu)良的哺乳動物明膠替代品[3]。但與哺乳動物明膠相比,FG的凝膠強度和流變學特性較差,這主要是因為FG的脯氨酸和羥脯氨酸含量較低,無法形成充足的氫鍵來穩(wěn)定明膠膠體的三股螺旋結(jié)構(gòu),使其應用范圍受到限制。所以,如何有效提高FG的凝膠特性是明膠領(lǐng)域的研究熱點之一[4]。目前,有關(guān)FG凝膠性的改善方法主要有生物酶交聯(lián)[4]、磷酸化修飾[4-5]、戊二醛交聯(lián)[6]和輻照[7-9]等,但這些改善方法存在生物酶交聯(lián)極易形成熱不可逆凝膠[10],戊二醛具有一定的神經(jīng)毒性[11],磷酸化和輻照修飾效果不夠明顯[12]等問題。研究表明,基于靜電相互作用的離子多糖(anionic polysaccharide,AP)能有效改善FG的凝膠性能[13-15],并且應用方法簡單,無毒性,可以食用。然而這種改性的程度與AP種類、添加量相關(guān),有關(guān)此類報道卻較少。因此,本文主要通過對比研究阿拉伯膠(arabic gum,AG)、黃原膠(xanthan gum,XG)和κ-卡拉膠(κ-carrageenan,κC)對FG的凝膠強度、質(zhì)構(gòu)特性和流變學等凝膠特性的影響,并結(jié)合傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)初探改性的機理,旨在為開發(fā)高品質(zhì)FG提供技術(shù)指導和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FG(來源于魚鱗和魚皮),上海源葉生物科技有限公司；AG,法國Nexira公司；κC、XG,上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

TA.XT Plus 質(zhì)構(gòu)分析儀,Stable Micro Systems 公司；DHR-2 流變儀,TA Instruments Inc 公司；FT/IR-4700 紅外吸收光譜儀,Jasco Corp 公司；Quanta200F 環(huán)境掃描電子顯微鏡,美國 FEI 公司。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

參照HUANG等[5]的方法略作修改,制備FG-AP復合溶液,其總固形物含量為60 mg/mL。按照FG∶AP為179∶1、35∶1、17∶1、11∶1、8∶1(m∶m)的比例稱取適量的干燥FG于超純水中,40 ℃水浴加熱至完全溶解,冷卻至室溫,隨后向FG溶液中分別添加適量的AG、κC和XG,250 r/min下攪拌混勻,分別配制成FG-AG復合體、FG-κC復合體和FG-XG復合體,置于冰箱備用。

2.2 凝膠強度的測定

參照KAEWRUANG等[16]的方法,利用質(zhì)構(gòu)儀對膠體進行凝膠強度測試。將混合溶液倒入25 mL的玻璃杯中,10 ℃孵化16～17 h。采用直徑為1.25 cm的P/0.5探頭對膠體進行凝膠強度測試,測前、測試、測后速度均為1 mm/s。以探頭進入膠體深度為4 mm時所受的最大力定義為凝膠強度。每組樣品平行測定3次。

2.3 質(zhì)構(gòu)特性的測定

參照HUANG等[5]的方法對膠體進行質(zhì)構(gòu)分析。將制備好的復合體溶液倒入模具中,10 ℃孵化16～17 h。取出膠體并切成直徑為2.5 cm,高度為1.5 cm的圓柱體小膠體。利用質(zhì)構(gòu)儀進行質(zhì)構(gòu)檢測,探頭為P/50,行變量為40%,循環(huán)測量2次,測前、測中、測后探頭移動速度均為1.0 mm/s。每組樣品平行測定3次。

2.4 流變學測試

2.4.1 凝膠動力學測試

參照HUANG等[5]的方法對制備的樣品進行凝膠動力學測試。移取3 mL的膠體溶液于流變儀平臺上,使用60 mm探頭,40 ℃保持5 min,設置最終溫度為4 ℃,系統(tǒng)自動降溫至4 ℃,保持3 h,頻率為 1 Hz,應變力為0.5%。構(gòu)建儲能模量(storage modulus,G′)隨時間動態(tài)變化方程為凝膠動力學方程,如公式(1)所示。

Gt=kgelln(tgel-A)+C

(1)

式中：Gt,t(s)時刻G′的值；tgel,凝膠時間；kgel,凝膠速率；C,常數(shù)。

2.4.2 溫度測試

參照HUANG等[5]的方法對膠體進行溫度測試。FG溶液先從40 ℃降溫至5 ℃,再從5 ℃升溫至40 ℃,速率均為0.5 ℃/min,應變力為0.5%,頻率為1 Hz。

2.4.3 黏度測試

參照HUANG等[5]的方法對膠體溶液進行剪切速率測試,測試溫度為25 ℃,剪切速率為0.01～1 000 s-1。

2.5 FTIR掃描

參照NAGARAJAN等[17]的方法,使用FTIR分析復合體的基團吸收峰特性。取凍干后的復合膠體與適量KBr粉末混合,充分研磨并壓片。在4 000～400 cm-1的范圍內(nèi)進行光譜掃描,分辨率為4 cm-1。所有的樣品光譜圖以KBr為背景。

2.6 環(huán)境掃描電鏡

參照ROUSI等[18]的方法,將冷凍干燥后的FG樣品置于樣品臺上并用導電膠帶固定,利用環(huán)境掃描電鏡(environment scanning electron microscope,ESEM)在低真空模式下觀測膠體的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。測試電壓為10 kV,放大倍數(shù)為300倍。

2.7 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復3次以上,數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。使用Origin 8.0作圖,采用SPSS 21.0軟件處理分析數(shù)據(jù),其中不同字母表示顯著差異(P<0.05)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同離子多糖對魚明膠凝膠強度和質(zhì)構(gòu)特性的影響

凝膠強度是破斷力和破斷距離的乘積,質(zhì)構(gòu)測試可以模擬膠體在人體口腔咀嚼過程中的品質(zhì)變化,兩者均是評價凝膠品質(zhì)的重要指標[5,17]。不同含量的AG、κC和XG對FG凝膠強度和質(zhì)構(gòu)特性的影響如表1所示。與原樣相比,在FG-AG和FG-XG復合凝膠體系中,復合膠體的凝膠強度和硬度均隨著AG和XG含量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,且均在比例為35∶1(m∶m)時,凝膠強度最高。結(jié)果表明,加入一定量的AG和XG可以提高復合膠體的凝膠強度和硬度,但過量的AG和XG反而會降低復合膠體的凝膠強度和硬度。FG和AP可以通過靜電相互作用形成FG-AP復合體,該體系的分子形成3種復合體：FG-FG、FG-AP和AP-AP。當AP含量低時,FG-FG復合體占主導地位,FG-AP復合體進一步增強膠體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當AP含量較高時,AP-AP復合體占主導地位,FG-AP復合體增強膠體的凝膠特性[19]。由于AG和XG是弱凝膠,所以當其含量過高時,AP-AP復合體占據(jù)主導地位,膠體的凝膠強度和硬度降低(P<0.05)。這可能是由于形成的FG-AP復合體抑制FG凝膠化過程中三股螺旋的形成,降低凝膠特性[19]。然而,在FG-κC復合凝膠體系中,凝膠強度隨著κC比例的增加而顯著提高,這可能是因為FG的脯氨酸殘基和κC分子上的半乳糖硫酸鹽殘基能緊密結(jié)合,增強體系的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),可以有效提高FG的凝膠強度[20-21]。此外,FG與AG/XG分子間可形成氫鍵,有助于增強復合膠體的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)[14]。復合膠體黏性和咀嚼性的變化趨勢和凝膠強度和硬度的趨勢保持一致。此外,隨著κC和XG含量的增大,FG-κC和FG-XG復合膠體的恢復力逐漸降低,FG-κC復合體的彈性和凝聚力也逐漸降低,而FG-AG復合體的恢復力、彈性和凝聚力卻無顯著性變化。這種差異性可能與多糖自身特性的不同有關(guān)。

表1 不同F(xiàn)G-AP復合體凝膠強度和質(zhì)構(gòu)特性分析Table 1 Gel strength and texture profile characteristics of various FG-AP complexes

3.2 不同離子多糖對魚明膠流變學特性的影響

3.2.1 凝膠動力學分析

為了研究時間對不同離子多糖對FG凝膠形成的影響,采用流變學中的時間掃描研究不同離子多糖對FG凝膠過程中G′和損耗模量(loss modulus,G″)的影響,從而對其凝膠形成動力學和凝膠力學穩(wěn)定性進行評價[22]。如圖1所示,前1 000 s時,所有凝膠體系的G′和G″以較快的速度增長,隨后以較小的速度繼續(xù)增加。在凝膠化過程中,當G′>G″時,預示著膠體正在形成。明膠的凝膠過程是明膠分子由無規(guī)則卷曲到三股螺旋轉(zhuǎn)變的過程,主要受pH、明膠的濃度、溫度等的影響。一旦膠體網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)形成,隨著時間的延長,G′繼續(xù)以較小的速度增加,預示著三股螺旋的繼續(xù)生成,凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)正在增強[19]。

明膠的凝膠化速率可被應用于了解明膠凝膠過程中模量的變化,推測三股螺旋的生成情況[5,19,23]。每個凝膠體系的凝膠動力學分析數(shù)據(jù)如表2所示,原樣的凝膠速率(k)為(1 433.60±29.02),高于FG-AG和FG-XG復合體體系,這可能是由于AG和XG與FG通過靜電相互作用生成的復合體會掩蓋三股螺旋結(jié)合位點,抑制了三股螺旋的生成[14,24]。此外,由于AG和XG屬于陰離子多糖,引入的負電荷增大了復合體系中的靜電斥力,降低了FG分子的流動性[14,18,25-27]。然而,在FG-κC復合體體系中,FG:κC比例為179∶1和35∶1(m∶m)時,k低于原樣；當FG∶κC為17∶1、11∶1和8∶1(m∶m)時,k高于原樣,且隨著κC含量的增加而增大。這可能是由于κC含量過高時,FG三螺旋和κC雙螺旋之間產(chǎn)生了互補作用,導致FG-κC體系具有更多的物理凝膠結(jié)合連接區(qū)[28],呈現(xiàn)出較高的凝膠強度和硬度(表1)。

表2 不同F(xiàn)G-AP復合體流變學特性分析Table 2 Rheological characteristics of various FG-AP complexes

3.2.2 溫度掃描分析

明膠的凝膠點和融膠點可以通過分析流變學溫度掃描過程中G′和G″的變化得到[5,29]。在40 ℃時,樣品為溶液狀態(tài),G′和G″的值較低,且G″>G′；在降溫過程中,G′和G″均隨著溫度的降低而升高,且當G′和G″形成交點時,所對應的溫度即是凝膠點,預示著凝膠正式開始生成；升溫過程中,G′和G″均隨著溫度的升高而降低,且當G′和G″形成交點時,所對應的溫度即是融膠點,預示著膠體開始融化[5,29]。一般而言,FG的膠融溫度(11～28 ℃)普遍低于哺乳動物明膠(28～31 ℃)[19],因此限制了FG的應用范圍。如表2所示,在相同的測試方法和參數(shù)下,適量的AG、XG和而增加κC有助于提高FG的凝膠點和融膠點：FG-AG復合膠體的凝膠點和融膠點均隨著AG含量的增加而增加,且當FG∶AG超過11∶1(m∶m)后,凝膠點和融膠點均逐漸降低；而FG-κC和FG-XG復合膠體的凝膠點和融膠點均隨著多糖含量的增加而逐漸升高,且當其含量達到一定時,溶液呈現(xiàn)為弱凝膠狀。不同多糖對FG凝膠點和融膠點影響的不同與多糖自身分子形態(tài)、構(gòu)象、分子質(zhì)量大小等有關(guān)[19]。κC是硫酸陰離子多糖,易與蛋白質(zhì)通過靜電相互作用生成穩(wěn)定的復合體[28,30],而XG側(cè)鏈含有可電離的三糖基團,表現(xiàn)出極強的聚電解質(zhì)行為[14-15,24,27],易與FG分子通過分子間的靜電相互作用生成穩(wěn)定的復合體,有助于FG凝膠點和融膠點的提高。明膠的膠融溫度主要受氨基酸組成、α鏈/β鏈的比例、分子質(zhì)量分布、電荷密度等因素影響[19]。因此,加入κC和XG可顯著提高FG的膠融溫度,改善其膠融溫度低的缺點。

3.2.3 表觀黏度分析

黏度是評價明膠品質(zhì)的關(guān)鍵指標之一,可以反映明膠產(chǎn)品的加工特性。黏度主要受到剪切速率、pH、溫度、剪切壓力和時間等的影響[5,31]。如圖2所示,相較于原樣,FG-XG和FG-κC復合體體系均具有較高的黏度,且黏度隨著XG和κC含量的增加而增加,而FG-AG復合體體系呈現(xiàn)相反的趨勢。在FG-AP復合體體系中存在著3種類型的分子復合體：FG-FG、AP-AP、FG-AP。當FG過量時,體系黏度主要由FG-FG結(jié)構(gòu)主導,FG-AP復合體進一步提高復合體體系的黏度；在FG含量較低時,體系黏度主要受AP-AP復合體的影響[19]。單純AP溶液的黏度為XG>κC>AG[14]。XG是線性高分子(2×106～2×107Da),分子鏈顯著高于AG(4×105Da)和κC(102～106Da),且具有更多的流體力學體積,很容易發(fā)生分子間的交聯(lián),因此FG-XG復合體具有較高的黏度[14]。

a-FG∶AG；b-FG∶κC；c-FG∶XG圖 2 不同F(xiàn)G-AP復合體系的流體特性分析Fig.2 Flow behavior analysis of various FG-AP complexes

剪切速率為50 s-1時所對應的黏度值(η50)被認為與食品的黏度、潤滑性等品質(zhì)相關(guān)[19]。如表2所示,FG-AG、FG-κC和FG-XG復合體體系的η50值均高于原樣。這可能是由于FG的分子質(zhì)量ɑ/β鏈比較低[1-2]。除此之外,與FG-AG復合體相比,FG-XG和FG-κC復合體體系均表現(xiàn)出較高的η50值。隨著AG含量的增加,FG-AG系統(tǒng)的η50值呈先上升后下降的趨勢；而對于另2個復合體體系而言,η50值均隨著XG和κC的含量增加而上升。這種差異可能是受多糖分子自身特征的差異影響,如分子質(zhì)量、分子構(gòu)象和電荷密度等[14]。因此,XG和κC更能賦予FG更好的感官品質(zhì)。

3.3 FTIR

a-FG∶AG；b-FG∶κC；c-FG∶XG圖 3 不同F(xiàn)G-AP復合體FTIR分析Fig.3 FTIR analysis of various FG-AP complexes

3種FG-AP復合體體系酰胺III的波數(shù)均低于原樣,表明了FG的β-轉(zhuǎn)角含量逐漸降低。此外,酰胺A反映N—H拉伸,然而FG-AP復合體體系的酰胺A波數(shù)明顯高于原樣,表明了3種多糖AG、XG和κC和FG生成了氫鍵。因此,加入AG、XG和κC這3種多糖會改變FG的二級結(jié)構(gòu),從而影響其凝膠特性。

表3 不同F(xiàn)G-AP復合體的FTIR分析 單位：cm-1

3.4 ESEM

不同種類的AP對FG空間結(jié)構(gòu)的影響如圖4所示,未修飾的FG膠體呈現(xiàn)塊狀和空隙；當FG∶AP=35∶1(m∶m)時,3種復合膠體的結(jié)構(gòu)發(fā)生了相似的改變,FG膠體呈現(xiàn)致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。其中,FG∶κC=35∶1(m∶m)時,膠體的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)小而密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),這與其凝膠性結(jié)構(gòu)分析相一致,且與FG-AG和FG-XG復合體相比較,κC對FG結(jié)構(gòu)改善效果更好。因此,適量的多糖有助于增強復合膠體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),膠體呈現(xiàn)出較高的凝膠特性,且κC的效果更好。

a-原樣；b-FG∶AG=35∶1；c-FG∶κC=35∶1； d-FG∶XG=35∶1圖4 不同F(xiàn)G-AP復合體SEM結(jié)果分析Fig.4 SEM analysis of various FG-AP complexes

4 結(jié)論

本研究探討了不同含量(FG∶AP=179∶1、35∶1、17∶1、11∶1、8∶1)的AG、XG和κC對FG凝膠特性和流變學特性的影響,為生產(chǎn)安全高品質(zhì)的魚明膠產(chǎn)品提供了有效的理論依據(jù)。結(jié)果表明,適量的AG、XG和κC能有效提高FG的凝膠強度、硬度、凝膠溫度和膠融溫度,且在FG∶AG和FG∶XG為35∶1(m∶m),FG∶κC為8∶1(m∶m)時,復合膠體具有更高的凝膠強度和硬度。凝膠動力學結(jié)果表明,AG、XG和低含量的κC會降低復合膠體的凝膠速率；剪切速率分析表明3種AP均會提高復合膠體的表觀黏度,其中高含量的XG和κC更加顯著地提高復合膠體的黏度。FTIR結(jié)果表明,加入的AP并不會破壞典型的FG官能團,但是FG與AP可通過氫鍵的形成改變酰胺A的波數(shù)。ESEM分析表明,在FG∶AP=35∶1(m∶m)時,加入的AG、XG和κC能有效改善復合膠體凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu),其中FG-κC復合膠體的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)更加致密?？偠灾?綜合凝膠強度、質(zhì)構(gòu)和流變學分析,高含量的κC更能高效地提高復合膠體的凝膠特性和黏度。