邵婉,王芮,周宇芳,相興偉,,孫繼鵬,王家星,廖妙飛,鄧尚貴,鄭斌*

1(浙江海洋大學 食品與醫(yī)藥學院,浙江 舟山,316021) 2(浙江省海洋開發(fā)研究院,浙江 舟山,316021) 3(浙江工業(yè)大學 食品科學與工程學院,浙江 杭州,310014)

氧化應激是由于生物系統(tǒng)中自由基的增加而發(fā)生的。在正常情況下,需氧生物通過組織良好的酶和非酶的自我防御系統(tǒng)來維持細胞穩(wěn)態(tài)[1]。然而,由于自由基的過度表達,機體的抗氧化能力降低,細胞分子受損,最終導致多種疾病的發(fā)生[2]。對細胞系統(tǒng)造成嚴重損害的自由基大部分是氧自由基,通常稱為活性氧(reactive oxygen species,ROS)。它們的普遍存在源自不平衡的氧穩(wěn)態(tài),導致細胞內(nèi)氧化應激的產(chǎn)生[3]。H2O2是造成氧化損傷的主要因素之一,它與誘導內(nèi)源性氧化應激有關(guān),從而導致細胞的致癌、突變和細胞毒性[4]。

近年來,研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞是研究抗氧化的合適模型。有研究表明,一些細菌的毒性是由于它們能夠通過刺激ROS的產(chǎn)生觸發(fā)活化巨噬細胞的死亡[5]。過量的ROS很容易轉(zhuǎn)化為H2O2,并通過血紅素催化的Fenton反應生成活性高、毒性強的·OH,最終導致巨噬細胞死亡[6-7]。巨噬細胞參與宿主防御,是促氧化劑作用的主要靶點,在識別和清除微生物病原體的宿主防御系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用[7]。鑒于巨噬細胞在免疫系統(tǒng)中的重要性及其易受ROS影響,利用巨噬細胞作為藥物篩選模型可以為研究天然產(chǎn)物在免疫系統(tǒng)中的抗氧化作用提供直觀的科學平臺。H2O2通常用于研究巨噬細胞凋亡或氧化應激介導的細胞損傷[8]。當機體受到氧化應激時,抗氧化劑可以延緩細胞損傷程度。目前,天然高效抗氧化劑的開發(fā)與應用受到越來越多的科研人員的關(guān)注。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦肽(peptides fromSolenoceracrassicornisby-products，SCBP)，實驗室自行制備，原料為舟山市越洋食品有限公司提供的紅蝦加工副產(chǎn)物蝦頭蝦殼，分子質(zhì)量：250～1 000 Da，蛋白質(zhì)量分數(shù)：61%。

小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7，中國科學院上海細胞庫；高糖杜爾伯科改良依格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)、澳洲胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、雙抗，美國Gibco公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒，南京建成生物工程研究所；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)試劑，TaKaRa公司； H2O2，美國Sigma；TRIzol試劑、CCK-8試劑盒、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)抗體、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch like-ECH-associated protein 1，Keap1)抗體，上海碧云天生物有限公司。其他試劑均為國藥試劑分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平(BP211D),美國Sartorius公司；pH計(PHS-3S),上海虹益儀器儀表有限公司；全自動酶標儀(Multiskan FC),美國Thermo Scientific科技有限公司；超純水儀(AdvantageA10),美國Milli-Qplus公司；超低溫冰箱(902-ULTS),美國Thermo Scientific科技有限公司；低溫高速離心機(TG20-WS),長沙湘智離心機儀器有限公司；核酸蛋白定量儀(ND-2000),美國Nanodrop公司；PCR儀(My Cycler),美國Bio-Rad公司；ABI 實時熒光定量PCR儀(ViiATM7),美國Applied Biosystems公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蝦肽的制備

按料液比1∶10(g∶mL)向紅蝦原料中加入95%乙醇混合,室溫下攪拌脫脂8 h,過濾,取濾渣,45 ℃烘干,備用。按料液比1∶2(g∶mL)向濾渣中加入蒸餾水,pH調(diào)至7.2,加入質(zhì)量分數(shù)2%堿性蛋白酶,于55 ℃下攪拌酶解5 h,90 ℃滅酶20 min,過濾取上清液。將酶解液進行 0.5 μm 孔徑無機陶瓷膜分離。收集透過液依次通過1 000和 250 Da的超濾膜,收集透過液和截留液,得到250～1 000 Da組分,冷凍干燥,即得蝦肽。

1.3.2 試驗細胞培養(yǎng)及處理

RAW 264.7用體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM(高糖)完全培養(yǎng)液于37 ℃在體積分數(shù)5%CO2細胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取指數(shù)生長期的RAW 264.7細胞用于實驗,預熱PBS洗3次,反復輕柔吹打,收集細胞,細胞計數(shù)板計數(shù),根據(jù)實驗需要調(diào)整細胞濃度進行種板,用于實驗。

1.3.3 CCK-8法測定細胞毒性

收集細胞,制成適宜濃度的細胞懸液,通過細胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù),而后用完全培養(yǎng)基稀釋到濃度為4×103/mL接種至96孔板,每孔100 μL,置于5%CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)12 h；待細胞充分貼壁后,分組加入不同濃度的藥物,每組設(shè)置3～6個復孔,同時設(shè)置空白組(不加藥物),培養(yǎng)24 h后,避光每孔加入10 μL CCK-8試劑,孵育1～4 h,待空白對照組達到橙黃色時結(jié)束,用酶標儀測定450 nm處的OD值。細胞存活率按公式(1)計算：

細胞的存活率/%=實驗組OD值/空白組OD值×100

(1)

1.3.4 蝦肽對H2O2損傷的RAW 264.7活力的影響

用不同質(zhì)量濃度的SCBP(200、400和600 μg/mL)預處理RAW 264.7細胞24 h,溫熱的PBS洗3次。除對照組外,其他組的細胞加入包含500 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基中12 h,然后每孔加入CCK-8 10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,用酶標儀測定450 nm處各孔的OD值。

1.3.5 氧化因子測定

6孔板接種對數(shù)生長期RAW 264.7細胞密度為2.5×104/mL,孵育24 h。去培養(yǎng)基,加入含有不同濃度SCBP的培養(yǎng)基孵育24 h,然后更換至500 μmol/L H2O2處理12 h。收集培養(yǎng)基上清液測定SOD,CAT和谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)的含量。

1.3.6 細胞因子 mRNA 表達水平的測定

6孔板接種對數(shù)生長期RAW 264.7細胞密度為2.5×104/mL,孵育24 h。去培養(yǎng)基,加入含有不同濃度SCBP的培養(yǎng)基孵育24 h,然后更換至500 μmol/L H2O2處理12 h。用1 mL PBS吹打下細胞,PBS洗3遍后轉(zhuǎn)移至無RNA酶的EP管中,加入1 mL預冷的TRIzol試劑,反復吹打裂解細胞,根據(jù)GenBank基因序列,用Primer Premier 5.0設(shè)計相應特異性引物,并由上海生物工程公司合成,按TRIzol試劑法提取細胞總RNA。用核酸蛋白定量儀檢測A260/A280、A260/A230及RNA濃度,使用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的純度。檢測后的總RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照TaKaRa公司的熒光定量試劑盒說明書配制反應體系,進行PCR反應。熒光的采集與溶解曲線的制作按照實時熒光定量PCR儀的說明進行。每個樣品靶基因的相對mRNA表達水平用2-ΔΔCt計算,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因為內(nèi)參。

1.3.7 Western Blotting法檢測Nrf2、Keap1蛋白表達

6孔板接種對數(shù)生長期 RAW 264.7 細胞2.5×104細胞/孔,孵育24 h。去培養(yǎng)基,加入含有不同濃度SCBP的培養(yǎng)基孵育24 h,然后更換至500 μmol/L H2O2處理12 h。用1 mL PBS吹打下細胞,收集細胞于1.5 mL EP管中,每管加入RIPA裂解液40 μL,吹打數(shù)次,置冰上裂解15 min。12 000 r/min、4 ℃,離心10 min,取上清液,按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行蛋白濃度測定。調(diào)整蛋白至相同濃度按比例加入蛋白上樣緩沖液,煮沸10 min,12 000 r/min、4 ℃,高速離心2 min,取上清液進行SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后,用脫脂乳粉配制質(zhì)量分數(shù)5%的復原乳封閉1 h,4 ℃下分別孵育Nrf2、Keap1一抗過夜,再與HRP-二抗室溫孵育2 h。使用碧云天BeyoECL Star(特超敏ECL化學發(fā)光試劑盒)顯影,將膜置于顯影液中,使用化學發(fā)光成像儀,觀察條帶,并拍照分析。

1.4 統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)應用GraphPad Prism 10.01軟件進行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)均用平均值±標準差表示,采用單因素方差(One-way ANOVA)多重比較進行差異顯著性檢驗,P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCBP對RAW 264.7細胞活力的影響

為了評估SCBP對RAW 264.7細胞增殖活力的影響,使用不同濃度的SCBP對細胞進行處理,并采用CCK-8法測定細胞的存活率。由圖1可知,ρ(SCBP)<600 μg/mL時對RAW 264.7細胞的存活率沒有影響(P>0.05),說明其對RAW 264.7細胞的代謝生長無明顯的毒性,但超過該濃度會降低細胞存活率(P>0.05)。因此,SCBP質(zhì)量濃度選擇200、400和600 μg/mL進行后續(xù)實驗。

圖1 SCBP質(zhì)量濃度對RAW 264.7細胞活力的影響Fig.1 Effect of SCBP on the viability of RAW 264.7 cells 注：組間不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)

2.2 SCBP對H2O2誘導RAW 264.7細胞活力的影響

H2O2可直接滲入細胞膜,導致氧化應激、線粒體損傷和細胞結(jié)構(gòu)破壞。為了評估SCBP對H2O2誘導的RAW 264.7細胞氧化損傷的保護作用,采用CCK-8法檢測細胞活力。結(jié)果表明(圖2),僅用500 μmol/L的H2O2處理RAW 264.7細胞的存活率與對照組相比明顯降低(P<0.05),這表明H2O2誘導RAW 264.7細胞構(gòu)建的氧化應激模型成功；然而用SCBP預處理的RAW 264.7細胞,與單獨用500 μmol/L H2O2處理的RAW 264.7細胞相比,細胞存活率顯著提高(P<0.05),表明SCBP對RAW 264.7細胞有明顯保護作用,能緩解H2O2對RAW 264.7細胞的氧化應激損傷。

圖2 SCBP預處理對H2O2誘導損傷的RAW 264.7 細胞活力的影響Fig.2 Effect of SCBP pretreatment on the viability of H2O2-induced RAW 264.7 cells

2.3 抗氧化酶的測定

SOD、CAT和GSH-Px是細胞內(nèi)抗氧化酶,能抑制自由基對細胞膜的攻擊,維持細胞健康。為檢測SCBP的抗氧化活性,研究了SCBP預處理對H2O2誘導的細胞GSH-Px、SOD和CAT水平的影響。由圖3可知,僅用500 μmol/L H2O2處理12 h后,CAT、GSH-Px和SOD水平與正常組相比均顯著降低(P<0.05),表明H2O2誘導巨噬細胞內(nèi)抗氧化酶受到嚴重破壞；與單獨H2O2組作用相比,蝦肽低、中、高劑量組的SOD、CAT活力均顯著升高(P<0.05),蝦肽各劑量組的GSH-Px活力有所增高,但無顯著性關(guān)系,說明蝦肽可減少氧化應激損傷并減輕脂質(zhì)過氧化,蝦肽高劑量組減輕H2O2對細胞損傷效果較好。

圖3 SCBP對RAW 264.7細胞的SOD(a)、GSH-Px(b)和CAT(c)水平的影響Fig.3 Effects of SCBP on the levels of SOD(a),GSH-Px(b)and CAT(c)in RAW 264.7 cells.

2.4 SCBP對GPX1/SOD1/NQO1/HO-1/Nrf2基因轉(zhuǎn)錄表達的影響

為研究SCBP保護氧化損傷RAW 264.7細胞的作用機制,測定了細胞內(nèi)SOD1、GPX1、Nrf2等 mRNA表達水平,結(jié)果如圖4。與空白組相比,單獨H2O2處理的細胞的SOD1、GPX1、Nrf2、NQO1、HO-1 mRNA的表達量均顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,蝦肽高劑量組(600 μg/mL)改善效果較好,蝦肽各劑量組細胞的SOD1、GPX1、HO-1 mRNA的表達量顯著提高(P<0.05)；蝦肽中、高劑量組細胞的Nrf2、NQO1 mRNA的表達量顯著提高(P<0.05),低劑量組(200 μg/mL)沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖4 SCBP對RAW 264.7細胞的GPX1(a)、SOD1(b)、NQO1(c)、HO-1(d)、Nrf2(e)mRNA表達水平的影響Fig.4 Effect of SCBP on the mRNA expression of GPX 1(a)、SOD1 (b)、NQO1(c)、HO-1(d)、Nrf2(e)in RAW 264.7 cells.

2.5 SCBP對Keap1-Nrf2信號通路的影響

通過Western Blotting檢測Nrf2以及Keap1的蛋白表達,探討SCBP抗氧化作用的分子機制。結(jié)果見圖5。與空白組相比,模型組的Nrf2的相對表達量顯著增加,而Keap1的相對表達量顯著降低(P<0.05)。不同劑量的SCBP均顯著地上調(diào)了Nrf2的表達,同時使Keap1的表達降低(P<0.05),其中SCBP為600 μg/mL時較其他劑量組顯著增加Nrf2的表達量,顯著減少Keap1的表達量(P<0.05)。說明SCBP通過調(diào)節(jié)Nrf2-Keap1信號通路來護H2O2誘導的細胞凋亡,具有劑量依賴性。

圖5 SCBP對RAW 264.7細胞Nrf2(a)和Keap1(b)蛋白表達的影響Fig.5 Effect of SCBP on protein expression of Nrf2 (a) and Keap1 (b) in RAW 264.7 cells

3 結(jié)論與討論

Nrf2作為一種轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化基因的產(chǎn)生和表達中起著關(guān)鍵作用。ARE是HO-1、SOD、CAT、GPx和NQO1等基因的上游啟動子區(qū)域,Nrf2通常與ARE結(jié)合,酶復合物上調(diào)了組織中內(nèi)源性抗氧化基因的表達,從而維持細胞氧化和抗氧化水平的平衡[22]。研究表明HO-1等細胞內(nèi)氧化還原基因是受Nrf2-ARE信號通路調(diào)控的主要內(nèi)源性保護基因[23]。HO-1具有多種作用,HO-1的高表達可顯著降低多種炎癥反應,減少組織損傷[24]。HO-1還可以調(diào)節(jié)血管平滑肌增生,維持血小板聚集和血管張力[25]。ARE激活后可誘導NQO1,對氧化應激反應具有保護作用[26]。SOD是細胞內(nèi)主要的抗氧化酶,也是細胞內(nèi)主要的自由基清除劑,具有保護細胞免受氧自由基侵害的作用。SOD的水平可以反映內(nèi)源性氧自由基清除系統(tǒng)的功能[27]。Keap1-Nrf2信號通路在保護細胞免受內(nèi)源性和外源性應激的影響中起著重要作用[28]。細胞質(zhì)蛋白Keap1與Nrf2相互作用并抑制其功能。在非應激細胞中,Nrf2與其抑制蛋白Keap1形成復合物,從而使其在細胞質(zhì)中失活并被阻斷。然而,當細胞暴露于輕度氧化應激時,Nrf2在其特定絲氨酸或蘇氨酸殘基處被磷酸化,從Keap1解離并轉(zhuǎn)移到細胞核中[29]。在本研究中,不同濃度蝦肽能促進抗氧化基因SOD1、GPX1、Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA水平表達,其表達水平隨著濃度的增加而有所增強,質(zhì)量濃度為600 μg/mL時具有較好的促進作用。各劑量組蝦肽均能顯著增加Nrf2的蛋白表達,減少Keap1的蛋白表達,高劑量蝦肽效果顯著。表明蝦肽預處理可使H2O2刺激后的細胞抗氧化基因表達增加,增加Nrf2蛋白表達量,減少Keap1蛋白表達量,從而緩解氧化應激。

綜上,蝦肽能緩解H2O2所引起的RAW 264.7細胞存活率降低,提高細胞內(nèi)SOD、GSH-Px、CAT活力,增加SOD1、GPX1、Nrf2等抗氧化基因的表達量,上調(diào)Nrf2的蛋白表達,下調(diào)Keap1的蛋白表達,說明蝦肽對H2O2引起的RAW264.7細胞氧化損傷具有一定的保護作用,與Nrf2/Keap1信號通路的激活有關(guān),為開發(fā)天然抗氧化劑奠定了基礎(chǔ)。