陳 利，蘇國旗，黃金秀，周曉容

(重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460)

0 引言

微生物在生態(tài)系統(tǒng)中主要起著分解者的作用。通過利用現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)，了解微生物的新陳代謝路徑及中間產(chǎn)物種類，對微生物的新陳代謝過程進(jìn)行人為調(diào)節(jié)，才能更好地服務(wù)于工業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。微生物總數(shù)達(dá)300萬種，遠(yuǎn)大于動(dòng)植物總數(shù)之和[1]，潛在的可開發(fā)利用的微生物資源巨大。利用微生物發(fā)酵技術(shù)可改善飼料營養(yǎng)及適口性、降低飼料毒性、提高可溶性蛋白含量、降低粗纖維含量、增強(qiáng)免疫、提高飼料報(bào)酬；提供有益微生物或者代謝產(chǎn)物開發(fā)出新型飼料[2-3]。有些微生物發(fā)酵產(chǎn)品還能夠消除臭味，降解糞污污染，并在病死畜禽無害化處理中具有重要作用，對于持續(xù)無污染養(yǎng)殖具有重要意義。

1 畜牧微生物研究方向

微生物種類繁多，而且微生物的基因表達(dá)新陳代謝途徑存在相互交叉。通過現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵代謝過程中存在畜牧產(chǎn)業(yè)中能促進(jìn)生產(chǎn)或者輔助生產(chǎn)的初級、次級代謝產(chǎn)物。比如利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶類、營養(yǎng)活性物質(zhì)類、香味劑、酸化劑、維生素、氨基酸以及發(fā)酵飼料類；利用微生物研發(fā)微生物飼料添加劑、微生物糞污以及病死畜禽處理添加劑等。

1.1 酶類開發(fā)

利用基因工程的方法可以使酶的表達(dá)量提升數(shù)個(gè)數(shù)量級，產(chǎn)業(yè)化后，添加至飼料中，對于飼料中難消化或者有毒有害物質(zhì)，能進(jìn)行比較充分的降解。對于一些高纖維難于消化吸收的飼料，還可利用酶解加上發(fā)酵的方法，提高飼料的營養(yǎng)價(jià)值。Grethe等[4]在液體發(fā)酵前48 h過程中添加聚葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶的混合酶，能提高菜籽餅和小麥干酒糟的飼料營養(yǎng)價(jià)值，這是一種分解非淀粉多糖NSP的方法。其他酶類資源有淀粉酶[5]、纖維素酶[6]等。

1.2 營養(yǎng)活性物質(zhì)類

潘予琮等[7]提出飼料營養(yǎng)活性物質(zhì)主要包括多糖類(抗氧化、抗菌作用[8])、黃酮類(抗菌、消腫、解熱等作用[9])、酚類(抗氧化、抑菌、調(diào)節(jié)腸道健康和增加抵抗力等作用[10])和揮發(fā)油(又叫植物精油，有增強(qiáng)免疫、抗炎、抑菌等功效[11])等四大類。這些飼料營養(yǎng)活性物質(zhì)主要存在于植物中，微生物在發(fā)酵過程中也會(huì)產(chǎn)生。在中草藥中對黃酮類、酚類、揮發(fā)油等物質(zhì)的提取多以物理、化學(xué)方法，如使用萃取、超聲波、微波、水蒸氣蒸餾法等。這些方法具有耗時(shí)長、生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)，而使用微生物發(fā)酵的方法，可以生產(chǎn)出不需要精提取的飼料營養(yǎng)活性物質(zhì)并可以使畜禽增加相應(yīng)活性物質(zhì)的吸收[12]，生產(chǎn)成本低，提高了經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1.3 小分子促進(jìn)生長因子

利用微生物能發(fā)酵生產(chǎn)香味劑(3-羥基丙酸、甲基戊基甲酮、十五酸乙酯等[13])、酸化劑(檸檬酸等[14])、維生素(VB2、VB12等[15])、氨基酸(賴氨酸、蛋氨酸等[16-17])、抗菌肽等。香味劑、酸化劑等能促進(jìn)動(dòng)物采食量，提高飼料消化率；維生素、氨基酸等能夠維持動(dòng)物的正常生長和繁殖；抗菌肽可調(diào)節(jié)免疫、抑制病原菌。小分子促進(jìn)生長因子對于禽畜的健康生長以及經(jīng)濟(jì)效益的提高，具有重要作用。

1.4 發(fā)酵飼料類

飼料及原料中含有種類眾多的抗?fàn)I養(yǎng)因子以及真菌毒素，如胰蛋白酶抑制因子、抗維生素、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A等[18]?？?fàn)I養(yǎng)因子和真菌毒素去除和降低的方法分為物理、化學(xué)以及生物方法。傳統(tǒng)的擠壓膨化、氨氣熏蒸等物理化學(xué)方法都相對劇烈，生物降解方法相對溫和，對于飼料原有營養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味影響較小，有些微生物甚至能改善原飼料的適口性以及增加飼料的營養(yǎng)價(jià)值[19]。利用微生物把動(dòng)物不易消化吸收的大分子物質(zhì)和抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行降解轉(zhuǎn)化，形成一種富含益生菌及生物活性成分的生物發(fā)酵飼料。這種飼料不僅利于動(dòng)物的消化吸收，而且改善微生態(tài)平衡，抑制或者殺死病原菌，從而提高動(dòng)物生產(chǎn)力[20]。比如菜籽粕含有硫代葡萄糖苷、單寧等抗?fàn)I因子，吳正可等[21]篩出一株嗜酸乳桿菌，對硫甙的降解率為39.25%，有效降低了抗?fàn)I養(yǎng)因子。此外，酵母菌含有動(dòng)物需要的各種必須氨基酸、蛋白質(zhì)以及各種礦物質(zhì)、糖類、維生素等。酵母菌能維持胃腸道微生態(tài)平衡，促進(jìn)益生菌生長，進(jìn)而提高動(dòng)物免疫力水平[22]，提高飼料效率[23]。此外，賈金如等[24]在稻草的固態(tài)發(fā)酵中，利用粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)發(fā)酵后，比未經(jīng)發(fā)酵的稻草的真蛋白含量提高了138.19%，飼料營養(yǎng)價(jià)值得到有效提升。

1.5 畜牧污染治理類

禽畜糞便在自然堆放過程中會(huì)產(chǎn)生H2S、NH3、甲基硫醇等有毒有害氣體，堆放位置不當(dāng)，輕則降低禽畜生產(chǎn)力，重則污染環(huán)境。在飼料中添加微生態(tài)制劑類除臭劑，可以在源頭上防止H2S、NH3的產(chǎn)生[25]。微生物在脫硫、除氨和清除有惡臭氣味的芳香族化合物具有重要作用。微生物除臭機(jī)理是通過硝化、反硝化以及氧化還原等作用轉(zhuǎn)換H2S、NH3等毒害氣體，并調(diào)控碳氮代謝，使有機(jī)物降解為芳香小分子有機(jī)物，減少氮素等揮發(fā)，減少臭味氣體形成[26]。微生物降解除臭方法無二次污染、效率高并且經(jīng)濟(jì)[27]。

在禽畜糞便中殘留抗生素的降解方面，有些微生物同樣起著重要的作用。孟應(yīng)宏等[28]從菌肥中篩選到一株高效土霉素降解菌T4假單胞菌 (Pseudomonassp.)，在豬糞中土霉素濃度為 50 mg/kg的堆肥實(shí)驗(yàn)中，土霉素的降解率達(dá)到了93.21%，能有效降解土霉素的污染。另外，Lin等[29]發(fā)現(xiàn)假單胞菌 EC22對濃度為1 mg/L的頭孢氨芐24 h的降解率大于90%?？股氐慕到庠硎俏⑸锓置诹艘环N修飾或者水解的酶類導(dǎo)致了抗生素分子結(jié)構(gòu)的破壞[30]。

在治理畜牧污水方面，微生物絮凝劑能起到很好的效果，是無二次污染的水處理劑[31]。微生物絮凝劑包括多糖、糖蛋白、纖維素、蛋白質(zhì)以及DNA等[32]。豬場污水前處理主要使用聚丙烯酰胺和聚合氯化鋁，化學(xué)絮凝劑衍生的許多單體對人體有害，如丙烯酰胺[33]和鋁離子[34]都與阿爾茨海默氏癥相關(guān)。微生物絮凝劑具有安全無毒，易于降解的特點(diǎn)。張魯新等[35]篩選到一株解淀粉芽孢桿菌 FD-14，能產(chǎn)生多糖類生物絮凝劑，對豬場污水絮凝率高達(dá)79%，比用化學(xué)絮凝劑高16.3%。此外，禽畜糞便難以處理的原因之一是禽畜未消化的纖維素在自然條件下降解過于緩慢。而篩選出的能耐受高溫的纖維素降解微生物是降解禽畜糞便中未消化纖維素和研制菌肥菌劑的重要材料[36]。微生物堆肥后，解決了養(yǎng)殖生產(chǎn)的廢棄物問題，并且為農(nóng)作物飼料源提供肥料[37]，實(shí)現(xiàn)循環(huán)經(jīng)濟(jì)。

1.6 病死畜禽無害化處理類

病死禽的處理一直是困擾養(yǎng)殖生產(chǎn)的難題，如果控制不好，極易造成水體和環(huán)境的污染[38]。李海龍[39]等從病死豬粉碎發(fā)酵鋸末堆肥中篩選能高效降解蛋白質(zhì)的耐受高溫菌株芽孢桿菌N-3 (Bacillusaestuarii)和高效降解脂肪的耐受高溫菌株嗜熱脫氮芽孢桿菌Y-3(Geobacillusthermodenitrificans)，兩種菌液等體積混合后，按0.6%的堆肥體積添加到堆肥中，能有效提高堆肥溫度，最高達(dá)到69℃，能夠加快病死豬的降解，有效殺滅病原微生物，達(dá)到無害化要求。

2 有開發(fā)潛力的微生物資源

2.1 極端環(huán)境微生物資源

在南北極和火山等極端條件下，這些環(huán)境下的微生物必定有獨(dú)特的基因組類型、獨(dú)特的生理代謝路徑。對這些微生物進(jìn)行研究，開發(fā)出耐受低溫、高溫或者耐鹽的酶類，比如蛋白酶[40]、糖類降解酶[41]等，這對于開發(fā)出新的飼料資源具有重要意義。

2.2 不可培養(yǎng)微生物資源

不可培養(yǎng)是指當(dāng)前的認(rèn)知水平或者實(shí)驗(yàn)條件下的不可培養(yǎng)。采用傳統(tǒng)的分離純化培養(yǎng)方式，能夠培養(yǎng)的微生物占1%左右，由于實(shí)驗(yàn)室無法完全模擬自然條件的真實(shí)狀態(tài)，忽略了微生物之間的相互作用，導(dǎo)致了大多數(shù)的微生物不可培養(yǎng)[42]。使其可培養(yǎng)的主要措施：①添加適當(dāng)?shù)碾娮觽鬟f鏈供受體(土壤中含有大量的未知功能的小分子有機(jī)物，Tuan[43]使用土壤浸出液作為培養(yǎng)基篩選出了比使用傳統(tǒng)稀釋分離純化方法多115種的未培養(yǎng)微生物)。②采用低營養(yǎng)的培養(yǎng)基或者使用無毒害的瓊脂替代物，可以降低對微生物的毒害作用(Yoichi[44]使用葛蘭膠代替瓊脂，從淡水沉積物篩選微生物，長出的菌落總數(shù)是使用瓊脂的10倍左右)。③瓊脂單獨(dú)滅菌比混合滅菌提高了沉積物中慢生菌分離總數(shù)量的55.56 %[45]；瓊脂單獨(dú)滅菌并延長培養(yǎng)時(shí)間，從土壤中篩選微生物，發(fā)現(xiàn)20 d生長的菌落總數(shù)量是2 d的4倍左右[45]。

3 篩選方法

3.1 稀釋涂布法

通過改變物理、化學(xué)條件的方法，如改變培養(yǎng)溫度、pH值、無機(jī)鹽濃度和氧氣含量，加入篩選化合物抗生素，使用營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基，進(jìn)而使用稀釋涂布方法得到純培養(yǎng)物[46]，再結(jié)合液體發(fā)酵，離心發(fā)酵液后用上清液進(jìn)行檢測，如觀察抑菌圈、透明圈、顯色圈等方法，能夠篩選得到目標(biāo)微生物。這種傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)的方法能更精確地對微生物的特性、生長代謝、生理或者單個(gè)有機(jī)體的細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)行研究。但是存在工作效率低，耗時(shí)耗力的問題。對于被檢測物質(zhì)表達(dá)量低但具有開發(fā)潛力的菌種極有可能存在漏篩的情況。

3.2 宏基因組技術(shù)

利用宏基因組技術(shù)，構(gòu)建宏基因組文庫，篩選微生物資源中特定酶類資源以及小分子生物活性抗菌物質(zhì)等，如脂肪酶[47]、抗菌肽類[48]。這種高新技術(shù)需要一定工作基礎(chǔ)，需要有對比數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對篩選。在不可培養(yǎng)的微生物種類中，蘊(yùn)含可以開發(fā)利用的微生物資源是豐富的，利用宏基因組技術(shù)可以提高篩選效率。

3.3 新的微生物篩選技術(shù)

由微流體技術(shù)衍生出多種微流體分離純化技術(shù)，如Jiang[49]等利用微流控平板劃線分離方法(MSP)進(jìn)行了高通量篩選(一種簡便的微流控條紋板(MSP)在納升液滴中進(jìn)行高通量微生物細(xì)胞分離和培養(yǎng)的方法)，并篩選出一株能夠降解熒蒽的未知芽球菌屬，對于篩選抗生素類降解菌是有所啟發(fā)的。Chen等[50]同樣發(fā)現(xiàn)皮升級的液滴的微流體是乳酸菌誘變改良的篩選方法，對乳酸菌的生產(chǎn)性能進(jìn)行了改善。

其他高新技術(shù)的微生物篩選方法有膜擴(kuò)散的培養(yǎng)方法，如分離芯片iChip[51]、中空纖維膜室HFMC等[52]，這些方法使用滲透膜，讓營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子擴(kuò)散到培養(yǎng)基，從而模擬更自然的環(huán)境。對于原位培養(yǎng)篩選菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件需要深度探索。細(xì)胞分選技術(shù)，如拉曼激活細(xì)胞分選(RACS)[53-54]、活細(xì)胞原位熒光雜交(live- FISH)[55]、反向基因組學(xué)[56]等，提供了一種以特定的功能或細(xì)胞亞群為目的分離篩選方法。然而這些微生物高新篩選技術(shù)都需要電子機(jī)械、人工智能技術(shù)的同步發(fā)展與支撐。幾種篩選方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，具體如表1所示。

表1 各篩選方法優(yōu)缺點(diǎn)

4 結(jié)語

微生物篩選就是要根據(jù)微生物的生長繁殖及新陳代謝特性，并且利用現(xiàn)代化的高新科學(xué)篩選技術(shù)進(jìn)行高效率篩選，更好地開發(fā)飼料微生物資源，這對于畜牧業(yè)發(fā)展具有重要意義。但是微生物利用中存在一些需要注意的問題：不同微生物發(fā)酵工藝不同，發(fā)酵飼料的營養(yǎng)價(jià)值略有不同；微生物發(fā)酵飼料缺乏科學(xué)的飼料營養(yǎng)評價(jià)體系；對于不同種類的牲畜適用什么種類的微生物發(fā)酵飼料，以及促進(jìn)生長的機(jī)理尚不明確。針對微生物發(fā)酵飼料，還要進(jìn)一步研究不同微生物之間互配或者飼料添加劑與菌體互配促進(jìn)生產(chǎn)的添加量以及促進(jìn)生產(chǎn)的機(jī)理。

對于篩選出的糞污臭味、病死禽處理類微生物，不僅需要了解單一菌種的作用機(jī)理，還需要考慮多種菌種配合使用，研究出合適的混合菌種的發(fā)酵工藝，提高糞污臭味、污水治理效果，才能達(dá)到更好的治理效果。不管是生產(chǎn)類還是糞污臭味治理類微生物都有必要加深基因組學(xué)、蛋白組學(xué)以及相關(guān)化合物新陳代謝途徑的研究，這樣才能更好地人為調(diào)控新陳代謝途徑及產(chǎn)物產(chǎn)量，并服務(wù)于生產(chǎn)。