徐瑩 操軒

心血管疾病(CVD)是慢性腎衰竭(CRF)患者的主要并發(fā)癥和首位死亡原因[1]。而慢性腎臟病患者并發(fā)心血管疾病大多與血管鈣化有關(guān)，故對CRF伴血管鈣化機制的研究在臨床上極為重要。其中建立類似人類CRF血管鈣化病理變化的理想動物模型是研究的前提。CRF患者的血管鈣化是一種類似于骨和軟骨形成的轉(zhuǎn)化過程[2]，而血管平滑肌細胞(VSMC)表達成骨細胞表型是該過程的中心環(huán)節(jié)[3-4]。骨形成蛋白(BMP)-2是骨細胞表型中重要成員之一，其下游骨轉(zhuǎn)錄因子同源盒基因2(Msx2)也起到重要作用。既往國外僅有體外實驗研究顯示Msx2參與動脈鈣化病變過程，故本實驗采用高磷飲食聯(lián)合腺嘌呤灌胃的方法制備新的CRF血管鈣化大鼠模型，探討Msx2在CRF血管鈣化大鼠體內(nèi)實驗中的作用機制。

材料與方法

1.材料：12周齡成年雄性SD大鼠30只及大鼠飼料均購于第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心，大鼠平均體質(zhì)量(200±20)g。腺嘌呤購于美國Amersco公司，Von Kossa特殊染色試劑盒購于美國Genmed Scientifics公司，核固紅復(fù)染試劑購于博士德生物工程公司，二氨基聯(lián)苯二胺(DAB)顯色劑及增強型(Polink-1)免疫組化試劑盒(貨號PV-6001)購于北京中山金橋公司，兔抗鼠同源盒基因Msx2(Hox8)多克隆抗體(貨號bs-6232R)購于北京博奧森公司。

2.方法

(1)分組與造模方法：選擇12周齡健康成年雄性SD大鼠，隨機分為3組，即正常對照組、腺嘌呤灌胃組、高磷飲食+腺嘌呤灌胃組,每組10只。將腺嘌呤加蒸餾水配成濃度為2.5%混懸液，置于4 ℃冰箱備用。所有大鼠以標準飼料喂養(yǎng)1周后，腺嘌呤灌胃組及高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠每日以腺嘌呤250 mg/kg灌胃，正常對照組采用等量蒸餾水灌胃，均持續(xù)6周。腺嘌呤灌胃組和正常對照組大鼠期間以標準飼料喂養(yǎng)，高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠予以高磷飲食喂養(yǎng)。高磷飲食配方參考文獻[6]，其中高磷飲食含磷約1.2%，普通飲食含磷約0.6%。

(2)標本采集：每日觀察大鼠狀態(tài)，并記錄大鼠體質(zhì)量、飲水量及尿量。于灌胃6周后將3組大鼠以3%戊巴比妥麻醉，心臟采血后予多聚甲醛心臟灌注致死，取出雙側(cè)腎臟及胸主動脈，肉眼觀察后再將標本固定在多聚甲醛中24小時備用。

(3)生化指標檢測：處死前于大鼠心臟采血3 ml，離心后取血清，檢測大鼠血鈣、血磷、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平。

(4)腎臟組織病理學檢查：將多聚甲醛中的大鼠腎臟組織進行蘇木素-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察并計算3組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)(TIL)評分：每張標本低倍鏡視野下隨機選取10個腎小球間質(zhì)視野，按照表1中各項觀察項目評分，各項評分總和為一個視野的評分，該標本的腎小管間質(zhì)TIL評分=10個視野評分的平均值[6]。

表1 腎小管間質(zhì)TIL評分標準

(5)胸主動脈病理學檢查：將多聚甲醛中的大鼠胸主動脈組織常規(guī)脫水后進行石蠟包埋，再制成3 μm切片，進行HE染色和Von Kossa染色。Von Kossa染色后觀察并進行鈣鹽沉積分級：0級，無鈣鹽沉積；1級，點狀沉積；2級，單個片狀沉積；3級，多個片狀沉積；4級，彌漫性沉積[7]。

(6)鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP)檢測Msx2在主動脈中的表達水平：每張大鼠胸主動脈組織切片隨機選取5個高倍視野(400倍)，鏡下見棕黃色為陽性部位，使用Image-pro Plus圖像分析軟件測定每個視野的陽性面積，取平均值。

結(jié) 果

1.3組大鼠一般情況：正常對照組大鼠造模6周后反應(yīng)靈敏，皮毛整齊，飲食及大便均正常，體質(zhì)量逐漸增長至(300±20)g。腺嘌呤灌胃組和高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠自造模2～3周后開始出現(xiàn)精神萎靡，攝食量減少，體毛脫落，飲水量及尿量均明顯增加；4～5周后開始出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、皮膚斑禿，攝食量、大便量及次數(shù)、尿量均減少；該兩組大鼠自灌胃開始體質(zhì)量均持續(xù)下降。造模過程中正常對照組10只全部存活，腺嘌呤灌胃組大鼠死亡3只，高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠死亡4只。

2.3組大鼠腎臟組織病理染色結(jié)果：肉眼觀察下，正常對照組大鼠腎臟組織呈深紅色、質(zhì)軟光滑。腺嘌呤灌胃組和高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠腎臟呈米黃色，體積顯著增大，類似“大白腎”，高度水腫、質(zhì)脆，皮髓質(zhì)分界不清。HE染色后鏡下觀察：正常對照組大鼠腎臟組織中腎小球、腎小管及腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)形態(tài)正常；腺嘌呤灌胃組與高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠腎臟組織中局部腎小管明顯萎縮或擴張、管腔內(nèi)可見少量管型，上皮細胞出現(xiàn)空泡變性或壞死脫落，腎間質(zhì)纖維化，大量炎性細胞浸潤；腎小球結(jié)構(gòu)破壞，少量纖維化，腎間質(zhì)及小管內(nèi)可見棕黑色結(jié)晶沉淀。見圖1。

圖1 3組大鼠腎臟組織HE染色結(jié)果(A：正常對照組；B：腺嘌呤灌胃組；C：高磷飲食+腺嘌呤灌胃組；×100)

3.3組大鼠生化指標及TIL評分比較：腺嘌呤灌胃組和高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠血磷、SCr、BUN水平及TIL評分明顯高于正常對照組(P<0.01)；高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠血磷水平高于腺嘌呤灌胃組(P<0.01)。3組大鼠血鈣比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組大鼠生化指標及TIL評分比較

4.3組大鼠胸主動脈組織病理染色結(jié)果：正常對照組大鼠胸主動脈HE染色結(jié)果顯示胸主動脈彈力層完整、細胞排列整齊；腺嘌呤灌胃組和高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠動脈血管正常結(jié)構(gòu)破壞，平滑肌細胞增生，彈力層中層結(jié)構(gòu)改變；其中高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠動脈平滑肌細胞增生更為明顯，結(jié)構(gòu)完全破壞。胸主動脈Von Kossa染色結(jié)果顯示，正常對照組大鼠胸主動脈組織染色呈粉紅色，未見黑色鈣鹽沉積，鈣鹽沉積分級為0級；腺嘌呤灌胃組和高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠胸主動脈組織中膜彈性纖維間可見黑色顆粒沉積于基質(zhì)和細胞內(nèi)，即鈣沉積；其中高磷飲食+腺嘌呤灌胃組更為嚴重，可見黑色顆粒呈明顯線條狀彌漫性分布，故腺嘌呤灌胃組鈣鹽沉積為2～3級，高磷飲食+腺嘌呤灌胃組為3～4級。見圖2。

圖2 3組大鼠胸主動脈組織病理染色結(jié)果(A、D：正常對照組；B、E：腺嘌呤灌胃組；C、F：高磷飲食+腺嘌呤灌胃組；A、B、C：HE染色；D、E、F：Von Kossa染色；×400)注：與正常對照組比較，aP<0.01；與腺嘌呤灌胃組比較，bP<0.01

5.3組大鼠胸主動脈平滑肌細胞中Msx2的表達水平比較：正常對照組大鼠主動脈中層血管平滑肌細胞中Msx2僅在胞漿中少量表達(86.60±12.79)，而腺嘌呤灌胃組(206.49±26.04)和高磷飲食+腺嘌呤灌胃組(336.74±38.92)大鼠平滑肌細胞胞漿及細胞外可見較多黃褐色物質(zhì)沉積，深染率高，提示Msx2表達增多，明顯高于正常對照組(P<0.01)。其中高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠血管平滑肌細胞可見黃色深染物質(zhì)沉積并聚集成片，其深染率明顯高于腺嘌呤灌胃組，提示Msx2表達水平高于腺嘌呤灌胃組(P<0.01)。見圖3。

圖3 3組大鼠胸主動脈平滑肌細胞中Msx2的表達(A：正常對照組；B：腺嘌呤灌胃組；C：高磷飲食+腺嘌呤灌胃組；免疫組化染色，×400)

6.影響Msx2表達的相關(guān)分析：Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，腺嘌呤灌胃組及高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠血磷(r=0.882，P<0.01)、鈣鹽沉積分級(r=0.858，P<0.01)與Msx-2的表達水平均呈正相關(guān)。

討 論

目前國內(nèi)成熟的CRF血管鈣化造模方法主要包括腎次全切除加高磷飲食誘導(dǎo)[8]、腎大部切除聯(lián)合維生素D3[9]及腺嘌呤灌胃[10]，其中腎次全切除方法操作復(fù)雜、易感染且死亡率高；而維生素D3方法會使鈣鹽沉積在彈力膜[9]，與尿毒癥血管鈣化表現(xiàn)不符，故均不作為首選方法。而腺嘌呤灌胃進入體內(nèi)，在黃嘌呤氧化酶作用下轉(zhuǎn)化為2,8-二羥基腺嘌呤，并沉積在腎小管，誘發(fā)腎功能衰竭，繼而出現(xiàn)電解質(zhì)紊亂，鈣磷代謝異常，形成動脈鈣化[11]。本實驗在腺嘌呤基礎(chǔ)上加入高磷飲食，結(jié)果證實高磷飲食聯(lián)合腺嘌呤灌胃方法制作血管鈣化模型效果更為顯著，為臨床CRF動脈鈣化相關(guān)研究提供了一個新的快速可靠的造模方法。

本實驗中大鼠胸主動脈鈣化病理結(jié)果基本與臨床典型的尿毒癥血管鈣化表現(xiàn)相似，即類似骨發(fā)育的、主動的、可調(diào)控的動脈鈣化過程，其表現(xiàn)為動脈中層鈣化，且鈣化部位周圍可見骨基質(zhì)樣蛋白，內(nèi)膜完整、結(jié)構(gòu)正常。終末期腎衰竭患者的血管鈣化也與尿毒癥導(dǎo)致的高磷血癥密切相關(guān)。本實驗中高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠胸主動脈血管正常結(jié)構(gòu)嚴重破壞，平滑肌細胞增生紊亂，Von Kossa染色結(jié)果顯示主動脈血管中膜組織間沉積了大量黑色顆粒，鈣鹽沉積為3～4級，均較腺嘌呤灌胃組嚴重，也提示高磷血癥誘導(dǎo)并加重了CRF血管鈣化程度。但其機制目前還尚未完全清楚，可能有以下3個方面：高磷可刺激血管平滑肌細胞(VSMC)中堿性磷酸酶(ALP)的表達，從而誘導(dǎo)并上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子CBFα1[12]，促進成骨細胞表型及成骨相關(guān)性蛋白的表達，誘發(fā)細胞鈣化；細胞內(nèi)高磷導(dǎo)致部分細胞凋亡，而后轉(zhuǎn)換為鈣化結(jié)晶，既往文獻研究表明凋亡小體可誘導(dǎo)VSMC鈣化[13]；細胞內(nèi)高磷還可刺激堿性磷酸酶(ALP)和鈣結(jié)合蛋白分泌[14]。

Wnt蛋白屬于分泌型的糖基化蛋白，可在血管平滑肌細胞中表達，而骨轉(zhuǎn)錄因子Msx2可通過上調(diào)多種Wnt蛋白配基的表達從而增強Wnt/β蛋白信號通路[15]。此通路可分別促進和調(diào)節(jié)間質(zhì)細胞、成肌纖維細胞向成骨細胞、成骨樣細胞分化增殖[16]。Msx2在CRF大鼠的鈣化血管內(nèi)大量表達，且與動脈鈣鹽沉積分級呈正相關(guān)，表明其在CRF動脈鈣化的整個進程中起重要作用。高磷飲食干預(yù)后血管內(nèi)Msx2表達則明顯增加，考慮其相關(guān)機制可能是由于高磷誘導(dǎo)并上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子CBFα1，促進骨形成蛋白(BMP)的表達，繼而上調(diào)其下游因子Msx2的表達，但具體的影響機制目前還尚未清楚，有待于進一步的實驗研究探討。

綜上所述，腺嘌呤灌胃聯(lián)合高磷飲食是較為合適的研究CRF血管鈣化的造模方法。CRF血管鈣化是一個類似成骨形成的過程，Msx2也參與了CRF血管鈣化病變的發(fā)生、發(fā)展過程，而高磷血癥會加重CRF血管鈣化程度，其機制可能與骨轉(zhuǎn)錄因子Msx2的表達水平升高有關(guān)。