徐偉麗 姚文山 賈利國 侯穎征 陳 靜

1華北理工大學生命科學學院 河北唐山 063210；2盤錦職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)療護理學院

美國癌癥學會發(fā)表的《2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)》，對185個國家/地區(qū)中的36種癌癥發(fā)病率和死亡率進行了統(tǒng)計，2020年全球癌癥新發(fā)病例和癌癥死亡病例分別為1930萬例和1000萬例[1]。世界范圍內(nèi)癌癥發(fā)病率和死亡率的負擔正在迅速增長，癌癥是全球主要的公共衛(wèi)生問題。C-1027是從我國湖北省土壤中分離的球孢鏈霉菌產(chǎn)生的抗腫瘤抗生素，對腫瘤細胞具有強烈的細胞毒性作用。細胞自噬通過將受損的細胞器和錯誤折疊的蛋白質(zhì)靶向到溶酶體，然后在其中降解，從而維持細胞穩(wěn)態(tài)的基本細胞過程[2-3]。細胞自噬水平的變化與腫瘤密切相關(guān)，目前對自噬發(fā)揮何種作用的研究已有很多，如自噬能在營養(yǎng)缺乏等不友好的環(huán)境下促進肝癌的生長[4-5]。也有研究表明自噬能夠抑制肝腫瘤的發(fā)生，ATG在其中發(fā)揮重要作用[6]。因此，本研究以人肝癌細胞為模型，研究了C-1027對肝癌細胞的抗腫瘤作用，并初步探討C-1027對肝癌細胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1材料來源 肝癌細胞系BEL-7402及C-1027均由中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所饋贈。

1.2MTT法檢測細胞毒作用 BEL-7402細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24h后加入不同濃度的C-1027，并設(shè)對照孔和調(diào)零孔，每組至少3個平行孔。48h后，每孔加入20μL5mg/mLMTT溶液，37℃、5%CO2孵育4h。吸棄上清液，每孔加入200μL DMSO，震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標儀測量570nm 的吸光度(A)。實驗重復3次以上。細胞存活率(%)=(加藥組細胞A值-本底A值)/(對照組細胞A值-本底組細胞A值)×100%。

1.3臺盼藍染色實驗 BEL-7402細胞接種于6孔培板中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后加入不同濃度的C-1027(0nM，0.01nM，0.10nM，1nM)孵育48h，胰蛋白酶消化細胞，DMEM培養(yǎng)基重懸，加入0.5%臺盼藍染液，染色后倒置顯微鏡下觀察，計數(shù)總細胞數(shù)和染色細胞數(shù)，計算各濃度C-1027對BEL-7402細胞的抑制率。細胞抑制率(%)=死細胞數(shù)/(或細胞數(shù)+死細胞數(shù))×100%。

1.4細胞克隆形成實驗 BEL-7402細胞以500個/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。加入不同濃度的C-1027(0nM，0.01nM，0.10nM，1nM)孵育48h，之后用新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3天觀察細胞狀態(tài)并更換新鮮培養(yǎng)液。直至每個培養(yǎng)皿中均出現(xiàn)50個以上克隆即終止試驗。4%多聚甲醛常溫固定，Giemsa溶液染色，顯微鏡觀察，記錄含有50個細胞以上的克隆個數(shù)。

1.5細胞自噬檢測 BEL-7402細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，24h后加入不同濃度C-1027(0nM，0.01nM，0.10nM，1nM)處理48h。用移液槍吸走培養(yǎng)基，PBS清洗細胞2次，每孔加入1mL AO工作液，避光染色30min，用PBS清洗去除多余的AO染液，然后在倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1C-1027對BEL-7402細胞活力的影響 采用MTT法測定C-1027對肝癌BEL-7402細胞活力的影響。將稀釋至不同濃度的C-1027處理肝癌細胞BEL-7402 48h。實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，C-1027以劑量依賴性的方式降低BEL-7402細胞的活力，誘發(fā)了人肝癌細胞的死亡，C-1027處理組細胞的存活率明顯降低，見圖1。統(tǒng)計分析顯示，C-1027對人肝癌BEL-7402細胞的IC50為0.405±0.029nM。

圖1 C-1027對BEL-7402細胞細胞活力的影響

2.2C-1027對BEL-7402細胞生存能力的影響 臺盼藍排斥實驗檢測細胞存活率，臺盼藍將死細胞染成藍色，活細胞不染色。C-1027以劑量依賴性降低BEL-7402細胞的存活率，抑制率如表1所示。

表1 不同濃度C-1027對BEL-7402細胞抑制率作用

2.3C-1027對BEL-7402細胞增殖的影響 為進一步確定C-1027可以抑制肝癌細胞存活的能力，進行了細胞克隆形成實驗，結(jié)果顯示，經(jīng)C-1027處理的BEL-7402細胞的克隆形成數(shù)量明顯少于空白對照組，且隨著C-1027濃度的增加，BEL-7402細胞的克隆形成數(shù)量越來越少，見圖2，克隆數(shù)呈現(xiàn)劑量依賴性。此外，從結(jié)果可以看出，當C-1027濃度達到0.1nM時顯現(xiàn)出了明顯的抑制作用，而當C-1027濃度達到1nM時，細胞的克隆形成數(shù)量幾乎為零。結(jié)果顯示，C-1027對BEL-7402細胞有顯著的抗增殖作用。

圖2 C-1027對BEL-7402細胞增殖的影響注：***P< 0.001。

2.4C-1027誘導BEL-7402細胞發(fā)生自噬 AO是一種自噬發(fā)生的熒光指示劑，它可以滲入細胞，將DNA和細胞質(zhì)染為亮綠色，因其對pH敏感，AO遇到酸性自噬泡時可以發(fā)出橘紅色熒光，該熒光能在熒光顯微鏡下觀察到。因此，可以用AO標記自噬泡并指示自噬的發(fā)生。結(jié)果顯示，C-1027劑量依賴性觸發(fā)了BEL-7402細胞自噬空泡細胞的積累。 BEL-7402細胞在不同濃度C-1027(0nM、0.01nM、0.10nM、1nM)處理后，AO對細胞染色，可以清楚觀察到?jīng)]有加入C-1027的空白對照組基本看不到橘紅色熒光的存在，隨著C-1027劑量的加大，BEL-7402呈現(xiàn)橘紅色熒光細胞的數(shù)量越來越多，見圖3。此外，橘紅色熒光強度也不斷加強，提示C-1027誘導BEL-7402細胞內(nèi)出現(xiàn)自噬泡，自噬被激活。

圖3 C-1027誘導BEL-7402細胞發(fā)生自噬(100×)注：A：對照組；B：0.01nM C-1027；C：0.1nM C-1027；D：1nM C-1027

3 討論

原發(fā)性肝癌是2020年全球第六大最常被診斷的癌癥和第三大癌癥死因，約有906000例新發(fā)病例和830000例死亡病例[1]。肝細胞癌是一種常見的惡性腫瘤，通常在慢性肝病的背景下出現(xiàn)。肝細胞癌的常見風險因素是慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染，慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染和酒精濫用。在現(xiàn)代治療方法中，晚期肝細胞癌患者幾乎沒有治療選擇，并且預后很差。肝癌的臨床表現(xiàn)取決于診斷階段和肝功能狀態(tài)。盡管肝癌的監(jiān)測程序相比以前完善了很多，但患者總體5年凈生存率仍然很低[7]，確定新的靶點和新的候選治療方案設(shè)計抗腫瘤藥物對肝癌的治療非常關(guān)鍵。

與其它類型的抗癌藥物相比，C-1027對多種腫瘤細胞具有極強的殺傷作用，具有高活性特點。此外，C-1027 還有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用[8]。這些研究表明，C-1027可能通過胞內(nèi)多種信號通路途徑對腫瘤細胞產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)，C-1027能夠顯著降低BEL-7402細胞的活力，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。同時，通過克隆形成實驗證明了C-1027對BEL-7402細胞的抗增殖作用。C-1027處理BEL-7402細胞后，酸性自噬泡數(shù)量增加，提示自噬泡的產(chǎn)生。證明C-1027誘導肝癌細胞發(fā)生自噬。其潛在的分子機制有待進一步研究。

自噬是一個基本的細胞過程，過量或錯誤折疊的蛋白及受損的細胞內(nèi)細胞器被雙膜自噬酶體吞噬，隨后在自溶酶體中降解[9]。自噬的作用是復雜的，因器官和器官而異。肝臟和肌肉等器官需要通過自噬作用來去除過多的脂質(zhì)積累、蛋白質(zhì)積累和線粒體的損傷，以防止產(chǎn)生過量的ROS而導致氧化應激[10]。自噬病中的缺陷與人類疾病的幾種發(fā)病機制有關(guān)，包括神經(jīng)退行性疾病[11]、心血管疾病[12]和癌癥[13]。已證明自噬失調(diào)在肝病，如酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、肝腫大、肝癌病和原發(fā)性肝臟惡性腫瘤中發(fā)揮作用[14-16]。最近發(fā)現(xiàn)的自噬與腫瘤進展和藥物反應之間的聯(lián)系強調(diào)了自噬在癌癥治療中的重要性[17-18]。目前研究表明，自噬根據(jù)不同的細胞環(huán)境在肝癌生存中發(fā)揮重要作用，探討自噬與肝癌的關(guān)系可能為肝癌帶來新的治療策略。