趙新紅，張作華，范 珊，侯雪芹，齊永秀，李 珂

（山東第一醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，山東 泰安 271000）

蛇床子、獨(dú)活等中藥材均含有蛇床子素的成分[1-2]，蛇床子素是香豆素類成分中最主要藥效成分，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、免疫調(diào)節(jié)，保護(hù)神經(jīng)，抗骨質(zhì)疏松，保護(hù)心血管，保護(hù)腎臟的功效，在現(xiàn)代藥理學(xué)中的作用尤為顯著[3]。

1 儀器與材料

Waters e2695 高效液相色譜儀（美國 Waters 公司），KQ-500E 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），F(xiàn)R224CN 型電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司），凱特離心機(jī)（鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），GM 0.33A 隔膜真空泵（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）

甲醇（美國天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?，水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），蛇床子素對照品（批號 17080510，含量質(zhì)量分?jǐn)?shù) 99.81%）。

蛇床子[Cnidium monnieri（L.）Cuss]、獨(dú)活（Angelica pubescensMaxim.f.biserrataShan et Yuan）、白芷[Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.ex Franch.et Sav]等藥店購買，產(chǎn)地四川，菟絲子（Cuscuta chinensisLam.）、白前[Cynanchum stauntonii（Decne.）Schltr.ex Levl]等藥店購買，產(chǎn)地安徽。以上中藥均由山東第一醫(yī)科大學(xué)中藥學(xué)教研室曲曉蘭副教授鑒定均符合《中華人民共和國藥典》2020 年版（一部）項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備

將適量蛇床子藥材于研缽內(nèi)研磨成粉末，稱取 5 g 置于 50 mL 棕色量瓶中，甲醇定容至刻度，超聲處理 30 min，室溫冷卻，甲醇補(bǔ)足至刻度，靜置片刻，于 3 000 r·min-1離心 5 min，將上清液經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜濾過，濾去初濾液 2.0～3.0 mL，取續(xù)濾液即得，備用。

2.1.2 對照品溶液的制備

取蛇床子素對照品適量，加甲醇定容至 25 mL 棕色量瓶中，搖勻，制得質(zhì)量濃度為 2.016 g·L-1的蛇床子素儲備液。

2.2 色譜條件

色譜柱為 Aglient C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-體積分?jǐn)?shù) 0.05% 磷酸（體積比 70:30）。檢測波長為 322 nm，流速為 1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為 10 μL，柱溫為 30 ℃[4]。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

分別將甲醇（溶劑）、蛇床子素對照品溶液、蛇床子供試品溶液，按照“2.2”條色譜條件進(jìn)樣，測得色譜圖。由圖1 可知，蛇床子素的保留時(shí)間為 11.9 min。供試品溶液主峰的保留時(shí)間與蛇床子素對照品的色譜峰保留時(shí)間一致。以蛇床子素色譜峰計(jì)算理論塔板數(shù)為 1 600，與相鄰組分分離較好。

Fig.1 HPLC of blank solvent (A), reference solution (B) and test solution (C)圖1 空白溶劑（A）、對照品溶液（B）和供試品溶液（C）的高效液相色譜圖

2.3.2 線性與范圍

分別精密量取蛇床子素對照品儲備液 0.496、2.73、4.96、7.19和9.43 mL 置 10 mL 量瓶內(nèi)，并用甲醇定容至刻度，搖晃均勻，即可得到質(zhì)量濃度為 0.100、0.550、1.00、1.45 和 1.90 g·L-1的蛇床子素對照品溶液，按“2.2”條色譜條件各質(zhì)量濃度對照品溶液分別進(jìn)樣 3 次，取平均值，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（ρ，g·L-1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。所得回歸方程為：A=3.0 × 107ρ- 3.0 × 105，r= 0.999 2。結(jié)果表明，蛇床子素在質(zhì)量濃度為 0.100～1.90 g·L-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn)

取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.2”條色譜條件，進(jìn)樣量為 10 μL，重復(fù)進(jìn)樣 6 次，記錄色譜圖，記錄蛇床子素的峰面積。計(jì)算蛇床子素的 RSD 為 0.36%，小于 3.0%，表明該方法的精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.1.1”項(xiàng)下方法新配制蛇床子供試品溶液，室溫下放置，分別在 0、2、4、6、8、10、12 h等不同時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)樣，記錄蛇床子素的峰面積。計(jì)算蛇床子素 RSD 為 0.45%，小于 3.0%，結(jié)果表明本蛇床子供試品溶液在 12 h 內(nèi)保持穩(wěn)定，穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取蛇床子粉末 6 份，分別按“2.1.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法配制溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，記錄蛇床子素的峰面積。計(jì)算蛇床子素的 RSD 為 0.28%，小于 3.0%，重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)

按“2.1.1”項(xiàng)下方法配制蛇床子溶液 3 份，分別按 80%、100%、120% 高中低 3 個(gè)不同質(zhì)量濃度精密量取對照品儲備液加入其中，甲醇定容至刻度，搖晃均勻，精密量取 1 mL 于進(jìn)樣瓶進(jìn)樣，進(jìn)樣量 10 μL，每種質(zhì)量濃度進(jìn)樣 3 次。每份按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。分別記錄其色譜圖峰面積。結(jié)果見表1。

Table 1 Recovery test results of osthol in samples表1 樣品中蛇床子素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.3.7 樣品含量測定

取菟絲子、獨(dú)活、白芷、白前等中藥藥材，分別將其置于研缽內(nèi)研成細(xì)粉，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試溶液，分別按“2.2”項(xiàng)下色譜條件取 3 份進(jìn)行測定[5]，結(jié)果見表2。

Table 2 Determination results of osthol in different Chinese medicinal materials（mg·g-1）表2 不同中藥材中蛇床子素含量測定結(jié)果（mg·g-1）

3 討論

通過在實(shí)驗(yàn)過程中對高效液相色譜條件的不斷優(yōu)化，使蛇床子素的出峰時(shí)間和分離效果較好，本實(shí)驗(yàn)首先通過對蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，進(jìn)行梯度洗脫以確定試驗(yàn)中流動相的大體比例，后采用等度洗脫對流動相的比例進(jìn)行調(diào)整，進(jìn)一步選擇最適合于該試驗(yàn)的流動相比例，來達(dá)到優(yōu)化的目的，使實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更加的可靠。

實(shí)驗(yàn)中以甲醇作為有機(jī)相，調(diào)試水相來使色譜峰分的更好，分別嘗試不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸、冰醋酸、磷酸等不同流動相作為該實(shí)驗(yàn)的水相[6-7]，進(jìn)樣蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品溶液得到標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，從色譜圖比較來看，當(dāng)水相為 0.05% 磷酸水溶液的時(shí)候，色譜圖中蛇床子素的所出的峰更加穩(wěn)定分離效果更好，與其他峰的干擾小。

關(guān)于蛇床子、獨(dú)活等中藥中蛇床子素的提?。骸吨腥A人民共和國藥典》2015 版（一部）均是采用無水乙醇溶解、超聲處理[8]，其提取方法簡便、快速，但無水乙醇極易揮發(fā)，導(dǎo)致所配制的溶液濃度極不穩(wěn)定，導(dǎo)致耗時(shí)、耗材。有文獻(xiàn)采用薄層色譜法測蛇床子素的含量[9]，手動操作比較多，人為的影響因素大，重現(xiàn)性不好。本實(shí)驗(yàn)在查閱以及研究文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用甲醇溶解、超聲，提取方法同于《中華人民共和國藥典》2015 年版，提取效果相似，配制的溶液較為穩(wěn)定。通過 e2695 高效液相色譜儀自動進(jìn)樣測定、消除人為因素，且方法簡便快捷，重現(xiàn)性較好。