曾維星， 程 賢， 畢良武*， 李勝男， 陳玉湘， 趙振東

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實(shí)驗(yàn)室；國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210042；2.南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

肉桂(CinnamomumcassiaPresl)屬于樟科植物，一般指桂皮，也分為桂皮、桂枝、桂葉，中國的主要產(chǎn)地有廣東、廣西、云南等省區(qū)。桂皮一般作為傳統(tǒng)的辛香料，用作食物烹飪的調(diào)味品，而肉桂枝葉則用于提取肉桂油。利用新鮮肉桂枝葉直接提取肉桂油，通常提取得率較低。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，肉桂油加工企業(yè)通常將肉桂枝葉貯存一段時間進(jìn)行自然陳化，通過加強(qiáng)肉桂枝葉代謝物的積累從而促進(jìn)肉桂油提取得率的提高。此外，隨著多學(xué)科的相互滲透和交叉，生物技術(shù)研究與天然產(chǎn)物研究的結(jié)合日益密切，微生物發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)開始作為生物預(yù)處理手段，應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取分離[1-4]。李軍集等[5]以經(jīng)水蒸氣蒸餾提取肉桂油后所得肉桂葉渣為原料進(jìn)行生物發(fā)酵，研究顯示發(fā)酵后肉桂葉渣的化學(xué)成分發(fā)生了明顯變化，產(chǎn)生了其他具有揮發(fā)性芳香氣味的化學(xué)成分。張?bào)谢薜萚6]利用微生物菌株XJ26的發(fā)酵液處理肉桂葉成功提取了肉桂醛等肉桂葉精油成分，并且在最優(yōu)工藝條件下，肉桂醛、香豆素和鄰甲氧基肉桂醛的提取得率分別為1.40%、 0.73%和0.92%，其中香豆素和鄰甲氧基肉桂醛的得率均高于已報(bào)道的數(shù)據(jù)。此外，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)肉桂枝葉經(jīng)酵母菌等預(yù)處理后，可以增加肉桂油的提取得率[7]。因此，明確不同預(yù)處理?xiàng)l件下肉桂枝葉主要化學(xué)成分的變化規(guī)律對于探索其預(yù)處理作用機(jī)理具有重要意義。本研究分別使用加水、加酵母液、45天陳化的方式對新鮮肉桂枝葉進(jìn)行預(yù)處理，先采用氣質(zhì)聯(lián)用鑒定肉桂油揮發(fā)性化學(xué)成分，再借助UHPLC-QTOFMS技術(shù)對空白對照組和預(yù)處理后的肉桂枝葉主要化學(xué)成分(包括揮發(fā)性和非揮發(fā)性成分)進(jìn)行全面表征，最后對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類和熱圖分析，探索肉桂枝葉主要化學(xué)成分經(jīng)不同方式預(yù)處理后的變化及其內(nèi)在轉(zhuǎn)化規(guī)律，以期為肉桂枝葉的生物預(yù)處理研究提供重要參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

新鮮肉桂枝葉，采摘自廣西梧州市藤縣金雞鎮(zhèn)；蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室純水儀制備；酵母粉，湖北安琪酵母股份有限公司；甲醇，市售分析純。

10 mL揮發(fā)油測定器，四川蜀玻公司。KH5200B型超聲波儀器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)儀，美國安捷倫公司；Waters Acquity BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，美國Waters公司；Shimadzu LC-30A Series UHPLC系統(tǒng)，配備SIL-20AC自動進(jìn)樣器，LC-20AD 二元泵，CTO-20A柱溫箱，SPD-M20A二極管陣列檢測器，日本島津公司；AB SCIEX QTOFTM 5600+質(zhì)譜儀system，美國SCIEX公司；移液槍、5424高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

1.2 生物預(yù)處理

取大小均勻的肉桂枝葉均分為4組，處理方式如下：1) 按肉桂枝葉與水質(zhì)量比5 ∶1將水均勻噴灑在枝葉表面，作為水預(yù)處理組(W)；2) 將0.1 g/mL的酵母水溶液按肉桂枝葉與酵母液質(zhì)量比5 ∶1均勻噴灑在枝葉表面，作為酵母液預(yù)處理組(Y)；3) 葉片不做任何預(yù)處理，作為空白組(C)。W、Y和C組枝葉分別置于玻璃培養(yǎng)皿中，并用透氣封口膜密封，靜置一周，葉片不做任何預(yù)處理，靜置45天，作為陳化存放組(A)。

1.3 肉桂油的提取及其成分鑒定

1.3.1肉桂油的提取 分別將空白組、水預(yù)處理組、酵母液預(yù)處理組和陳化存放組的肉桂枝葉用小型植物粉碎機(jī)粉碎成約1 cm×1 cm大小的碎葉片，使用水蒸氣蒸餾法提取6 h，冷卻后從油水分離器中收集肉桂油，稱質(zhì)量，計(jì)算肉桂油提取得率。

1.3.2肉桂油成分鑒定 吸取10 μL提取得到的肉桂油加入到40 μL甲醇中，稀釋至原體積的5倍進(jìn)樣氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。GC-MS分析條件：色譜柱為石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為He，流量1.6 mL/min；進(jìn)樣口溫度為170 ℃；進(jìn)樣量為0.2 μL；分流比為100 ∶1；色譜柱升溫程序?yàn)?80 ℃保持2 min，以3 ℃/min的速率升至170 ℃保持10 min。質(zhì)譜條件：EI電離源，電離源溫度為230 ℃，電子轟擊能量為70 eV，掃描范圍(m/z)為50～500。

1.4 肉桂枝葉提取物制備及分析

1.4.1樣品制備 將不同方式處理的肉桂枝葉用小型粉碎機(jī)粉碎至粒徑約0.4 mm，稱取0.26 g左右粉碎的肉桂枝葉轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，平行加入8 mL甲醇后蓋緊離心管，使用功率250 W，頻率40 kHz 超聲波處理10 min后取出放置12 h；第二天再次超聲波處理10 min后取出，取上清液1 mL轉(zhuǎn)移至離心管，10 000 r/min離心5 min后取出，用移液槍吸取0.8 mL上清液至進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行UHPLC-QTOFMS分析，每組樣品平行操作6次。同時將所有提取后的樣品等量混合后進(jìn)行UHPLC-QTOFMS分析，用于化合物鑒定。

1.4.2色譜條件 Shimadzu LC-30A Series UHPLC系統(tǒng)，柱溫為35 ℃。流動相為0.1%甲酸/水(A)和乙腈(B)，流速為0.2 mL/min。流動相梯度：0～3 min，5% B；3～10 min，5%～60% B；40～45 min，60%～95% B；45～55 min，95% B；55～56 min，95%～5% B；56～60 min，5% B，進(jìn)樣體積為2 μL。

1.4.3質(zhì)譜條件 AB SCIEX QTOFTM 5600+質(zhì)譜儀，ESI離子源，正負(fù)離子模式下進(jìn)行檢測。霧化：N2，1.5 L/min；干燥器：N2，140 kPa；CID碰撞氣：氬氣，50 kPa；解簇電壓90 V；碰撞能45 V；離子源溫度350 ℃；毛細(xì)管溫度300 ℃；掃描范圍(m/z)50～1 000；所有樣品數(shù)據(jù)采集均采用全掃描模式，非靶向模式獲得MS/MS二級碎片。

1.5 數(shù)據(jù)處理

肉桂油提取得率(Y)計(jì)算公式如下：Y=(me/mt)×100%，其中Y為肉桂油提取得率，%；me為收集的肉桂油質(zhì)量，g；mt為用于提取的肉桂枝葉質(zhì)量(以干質(zhì)量計(jì))，g。液相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)借助美國AB公司Peak View軟件對化合物的分子式進(jìn)行分析；數(shù)據(jù)分析及繪圖使用Originlab Corporation公司Origin2018軟件；化合物結(jié)構(gòu)式繪制采用ChemBioDrawUltra 14.0。GC-MS數(shù)據(jù)對比譜庫，鑒定肉桂油的成分，根據(jù)峰面積歸一化法計(jì)算得到各成分的相對峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物預(yù)處理對肉桂油提取得率及其成分的影響

以原料枝葉的干質(zhì)量計(jì)算不同預(yù)處理方式下的肉桂油提取得率。酵母液預(yù)處理組(Y)、水預(yù)處理組(W)、空白組(C)和陳化存放組(A)枝葉的肉桂油提取得率分別為0.76%、 0.68%、 0.63%、 0.95%?？梢钥闯?，空白組、水預(yù)處理組、酵母液預(yù)處理組和陳化存放組的提取得率比為1 ∶1.08 ∶1.21 ∶1.51。利用酵母液預(yù)處理原料枝葉后肉桂油提取得率相比空白組提高20.63%，雖然酵母液預(yù)處理組的肉桂油提取得率低于陳化存放組，但預(yù)處理時間僅為7天，遠(yuǎn)小于陳化存放時間(45天)。陳化過程中伴隨著肉桂枝葉中部分化學(xué)成分向肉桂油成分的轉(zhuǎn)化，推測利用酵母進(jìn)行預(yù)處理，加快了陳化的轉(zhuǎn)化過程。因此，利用酵母液作為預(yù)處理手段，能夠在較短時間內(nèi)促進(jìn)肉桂油提取得率的提高。

借助氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀得到譜圖，結(jié)合NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫以及Pub Med數(shù)據(jù)庫，共鑒定出了10種化合物，利用峰面積歸一化法計(jì)算得到各個化合物的相對峰面積，結(jié)果見表1。

表1 不同預(yù)處理方式下的肉桂油成分

由表1可知，4組原料枝葉提取所得肉桂油中主要化學(xué)成分相同，反式肉桂醛為含量最高的成分。經(jīng)過生物預(yù)處理或自然陳化干預(yù)后，主成分反式肉桂醛含量有所下降，但考慮到4組肉桂油提取得率本身存在差異，空白組、水預(yù)處理組、酵母液預(yù)處理組和陳化存放組提取所得肉桂油中的反式肉桂醛的實(shí)際量的比為1 ∶1.01 ∶1.06 ∶1.25，因此，預(yù)處理后反式肉桂醛實(shí)際量均有所增加。此外，在生物預(yù)處理后鄰甲氧基肉桂醛、乙酸肉桂酯實(shí)際量也有所增加。

由此可見，以酵母液預(yù)處理和自然陳化后所得肉桂油的主要組成成分基本一致，并且生物預(yù)處理有助于肉桂油中反式肉桂醛等主成分的積累。

2.2 肉桂枝葉甲醇提取物成分的鑒定

為了進(jìn)一步明確肉桂枝葉甲醇提取物成分(包括揮發(fā)性和非揮發(fā)性成分)在預(yù)處理干預(yù)下的變化規(guī)律，本研究采用高分辨質(zhì)譜儀對肉桂枝葉甲醇提取物分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行檢測，混合樣品的質(zhì)譜離子流圖如圖1所示。綜合考慮化合物的保留時間、精確相對分子質(zhì)量、分子式、相對分子質(zhì)量偏差、特征離子碎片及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，鑒定出了34個化學(xué)成分，包含17個酸類化合物、5個醇類化合物、4個苷類化合物、 3個醛類化合物、3個黃酮類化合物和2個酯類化合物，鑒定結(jié)果見表2。

a.正離子模式 positive ion mode； b.負(fù)離子模式 negative ion mode

表2 肉桂枝葉甲醇提取物成分的定性分析

續(xù)表2

化合物1的保留時間為18.71 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z163.07，其加和形式為[M+H]+，根據(jù)元素構(gòu)成規(guī)則和軟件分析，推測出該化合物的分子式為C10H10O2，其相對分子質(zhì)量偏差為-0.5，其中離子碎片m/z135.09分析推測為準(zhǔn)分子離子失去1個CO(28 u)后產(chǎn)生的，離子碎片m/z107.05則是準(zhǔn)分子離子相繼失去1個CO和1個C2H4(28 u)后產(chǎn)生的，推斷化合物1為鄰甲氧基肉桂醛，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(I)所示。結(jié)合文獻(xiàn)[8]，同理推斷醛類化合物2為反式肉桂醛[9]，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(II)所示，化合物3為松柏醛[10]。

化合物4的保留時間為12.63 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z287.05，其加和形式為[M+H]+，根據(jù)元素構(gòu)成規(guī)則和軟件分析，推測出該化合物的分子式為C15H10O6，其相對分子質(zhì)量偏差為-0.9，其中離子碎片m/z165.02分析推測為準(zhǔn)分子離子C環(huán)(C6H6O，94 u)斷開后，再失去一個CO(28 u)后產(chǎn)生的，離子碎片m/z153.02為AB環(huán)C—C的斷裂，即Retro Diels-Alder(RDA)反應(yīng)，結(jié)合文獻(xiàn)[11]，推斷化合物4為山柰酚，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(III)所示。同理推斷其他黃酮類化合物5和6分別為槲皮素、蘆丁[12]。

化合物10的保留時間為7.39 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z327.11，其加和形式為[M-H]-，根據(jù)元素構(gòu)成規(guī)則和軟件分析，推測出該化合物的分子式為C15H20O8，其相對分子質(zhì)量偏差為-6.6，其中離子碎片m/z147.05推測為準(zhǔn)分子離子失去1分子葡萄糖(C6H12O6，180 u)后產(chǎn)生，離子碎片m/z103.06推測為準(zhǔn)分子離子相繼失去1分子葡萄糖和1分子CO2(44 u)后產(chǎn)生，因此推斷化合物10為木犀草苷[9]，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(IV)所示。同理推斷其他苷類化合物7、8和9分別為槲皮苷[13]、金絲桃苷[14]和槲皮素-3-O-木糖苷。

化合物11的保留時間為18.71 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z135.08，其加和形式為[M+H]+，根據(jù)元素構(gòu)成規(guī)則和軟件分析，推測出該化合物的分子式為C9H10O，其相對分子質(zhì)量偏差為0.4，其中離子碎片m/z103.05分析推測為準(zhǔn)分子離子相繼失去1個H2O(18 u)和1個CH2(14 u)后產(chǎn)生的，這與已知肉桂醇的離子碎片解離路徑一致[8]，因此推斷化合物11為肉桂醇，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(V)所示。同理推斷其他醇類化合物12和13分別是松脂醇[14]和丁香樹脂醇[15]，化合物14和15分別為豆甾醇和肉桂萜醇A[14]。

化合物16的保留時間為11.63 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z147.04，其加和形式為[M+H]+，根據(jù)元素構(gòu)成規(guī)則和軟件分析，推測出該化合物的分子式為C9H6O2，其相對分子質(zhì)量偏差為0.9，其中離子碎片m/z101.04分析推測為準(zhǔn)分子離子相繼失去1個CO(28 u)和1個H2O(18 u)后產(chǎn)生的，離子碎片m/z91.05分析推測為準(zhǔn)分子離子失去2個CO(28 u)后產(chǎn)生的，這與香豆素酯鍵結(jié)構(gòu)處斷裂相吻合[16]，推斷化合物16為香豆素，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(VI)所示。同理推斷其他酯類化合物17為水楊酸乙酯[17]。

化合物23的保留時間為2.62 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z355.09，其加和形式為[M+H]+，根據(jù)元素構(gòu)成規(guī)則和軟件分析，推測出該化合物的分子式為C16H18O9，其相對分子質(zhì)量偏差為-6.9，其中離子碎片m/z193.05推斷為準(zhǔn)分子離子失去一個咖啡酸(180 u)所產(chǎn)生，m/z163. 09推斷為準(zhǔn)分子離子失去一個奎寧酸(192 u)后繼續(xù)失去一個H2O所產(chǎn)生，上述2種碎片與綠原酸酯鍵斷裂所得碎片完全一致，結(jié)合文獻(xiàn)[17]，推斷化合物23為綠原酸，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(VII)所示。同理推斷化合物18為肉桂酸，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(VIII)所示。其他酸類化合物19～25分別為芥子酸、香草酸、異香草酸、咖啡酸、綠原酸、對香豆酸、鄰香豆酸[8,17-18]。27～29分別為丁香酸、對羥基苯甲酸、3,4-二羥基苯甲酸[18]。

化合物31的保留時間為53.41 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z339.32，其加和形式為[M+H]+，根據(jù)元素構(gòu)成規(guī)則和軟件分析，推測出該化合物的分子式為C22H44O2，其相對分子質(zhì)量偏差為-9.6，其中離子碎片m/z183.25推斷為準(zhǔn)分子離子失去一個C11H24(156 u)所產(chǎn)生，上述碎片與山崳酸碳鏈斷裂所得碎片完全一致，結(jié)合文獻(xiàn)[8]，推斷化合物31為山崳酸，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(IX)所示。同理推斷其他酸類化合物26為二十七烷酸，化合物30為油酸，化合物32～34分別為花生酸、軟脂酸、硬脂酸[18]。

另外，通過表2與表1相關(guān)成分比對后發(fā)現(xiàn)，肉桂油揮發(fā)性次要成分乙酸肉桂酯在肉桂枝葉甲醇提取物中未被檢測到，目前尚不清楚其原因。當(dāng)然提取肉桂油的水蒸氣蒸餾法與分離提取物的甲醇提取法是有區(qū)別的，肉桂油和甲醇提取物檢測所用手段(GC-MS與UHPLC-QTOFMS)的檢測器也不盡相同。

圖2 肉桂枝葉化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解路徑

2.3 生物預(yù)處理干預(yù)下肉桂枝葉成分的變化規(guī)律

首先利用熱圖聚類分析描述了4組樣本34種化學(xué)成分質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度的接近程度，將34種化學(xué)成分分為3個級別，結(jié)果如圖3所示。第I級包括反式肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛、肉桂醇、肉桂酸、松柏醛等，大部分屬于醛類化合物，在肉桂枝葉中的含量較高且在離子源中容易離子化[19]。

C：空白組 control；W：水處理組water pretreatment；Y：酵母液處理組yeast pretreatment；A：自然陳化aging

第I級包括的化合物的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度見表3。由表3可以發(fā)現(xiàn)，肉桂枝葉經(jīng)酵母液預(yù)處理后，反式肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛、肉桂醇、肉桂酸、香豆素、松柏醛的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度在Y組樣品中最高。已有報(bào)道表明酵母菌預(yù)處理能夠通過破壁作用促進(jìn)天然產(chǎn)物的提取[20]，這可能是酵母液預(yù)處理促進(jìn)肉桂油提取得率提高的重要誘因。

第II級化合物包括松脂醇等，共計(jì)17種化學(xué)成分，屬于肉桂枝葉的次要成分，大部分屬于非揮發(fā)性化合物。通過熱圖分析可以發(fā)現(xiàn)：肉桂枝葉的次要成分在酵母菌預(yù)處理后的變化趨勢與自然陳化干預(yù)下的變化趨勢一致，具體表現(xiàn)為肉桂枝葉的次要成分在Y組和A組樣品中的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度普遍低于C組。因此，初步推斷在生物預(yù)處理或自然陳化過程中肉桂枝葉次要成分可能發(fā)生了轉(zhuǎn)化，具體機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，可以發(fā)現(xiàn)：1) 酵母液預(yù)處理促進(jìn)了反式肉桂醛等揮發(fā)性成分在肉桂枝葉中的積累；2) 肉桂枝葉的非揮發(fā)性成分在生物預(yù)處理干預(yù)下的變化趨勢與自然陳化干預(yù)下的變化趨勢一致。因此，本研究所涉及的生物預(yù)處理方式對改善肉桂枝葉的陳化轉(zhuǎn)化有積極指導(dǎo)作用。

3 結(jié) 論

3.1采用加水、加酵母液和45天自然陳化3種方式預(yù)處理肉桂枝葉，考察預(yù)處理方式對肉桂油及肉桂枝葉甲醇提取物中主要成分的影響。結(jié)果表明：經(jīng)過酵母液預(yù)處理原料枝葉后，肉桂油提取得率相對于空白組提高20.63%，因此，生物預(yù)處理手段能夠在較短時間內(nèi)促進(jìn)肉桂油提取得率的提高。同時，以生物預(yù)處理干預(yù)后所得肉桂油和自然陳化后所得肉桂油的主要成分組成基本一致。

3.2采用UHPLC-QTOFMS技術(shù)對4組肉桂枝葉甲醇提取物進(jìn)行分析，通過參照比對等分析手段從肉桂枝葉甲醇提取物中共鑒定出了34個化合物，包含17個酸類化合物、5個醇類化合物、4個苷類化合物、3個醛類化合物、3個黃酮類化合物和2個酯類化合物。

3.3酵母液預(yù)處理干預(yù)下，肉桂枝葉提取物中揮發(fā)性成分的相對含量有所提高，非揮發(fā)性成分的相對含量有所下降，變化趨勢與自然陳化干預(yù)下的變化趨勢一致，因此生物預(yù)處理在肉桂油提取方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。