肖 帆，張利平，朗 俠，吳建平，張筱艷，靳繼鵬

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，蘭州 730070)

甘肅省的綿羊品種主要有甘肅高山細毛羊、蒙古羊、灘羊和藏羊等[1]。甘肅高山細毛羊是著名的毛肉兼用品種，由新疆細毛羊、高加索細毛羊與當(dāng)?shù)夭匮?、蒙古羊雜交育成[2]。遺傳多樣性從狹義上來說，是指生物種內(nèi)基因的變化。生物在長期演化過程中，產(chǎn)生遺傳多樣性的根本原因是遺傳物質(zhì)的改變，一個物種在進化過程中基因突變越多其遺傳變異越豐富，且對環(huán)境變化有更強的適應(yīng)能力[3]。線粒體DNA在生物的起源進化、遺傳多樣性、親緣關(guān)系鑒定、保護動物的種質(zhì)資源等方面具有很重要的意義。

動物細胞核外的遺傳物質(zhì)主要是mtDNA，它是動物起源進化及群體遺傳分化的理想研究對象[4]。綿羊mtDNA物理結(jié)構(gòu)包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)。非編碼區(qū)又稱取代環(huán)(displacement loop，D-loop)，是線粒體基因組的控制區(qū)，位于 tRNApro和tRNAphe之間[5]。Dudu等[6]對無親緣關(guān)系的綿羊D-loop區(qū)和cytb基因測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有12個單倍型，單倍型多樣度為0.897，核苷酸多樣度為0.00437。Aljubouri等[7]通過研究伊朗3種多胎綿羊的D-loop區(qū)遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)它們在地理分布和表型性狀上存在明顯差異。Arora等[8]對3個不同地區(qū)的19個品種綿羊mtDNA多樣性進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在印度綿羊中共有37個單倍型，有兩個不同的母系起源。通過對D-loop區(qū)測序來評估肥臀羊的親緣關(guān)系，結(jié)果顯示埃塞俄比亞東部綿羊有2個母系起源[9]。而對中國藏羊D-loop序列的分析表明，該品種有3個母系起源，在藏羊中沒有單倍群D和E[10]。Fan等[11]分析表明，中國地方綿羊品種聚集到一個分支，而國外綿羊品種緊密聚集到另一分支。Zhao等[12]通過分析7個地區(qū)的16個地方品種mtDNA D-loop序列，發(fā)現(xiàn)在不同地區(qū)的所有品種中均存在A、B和C3種單倍群。汪琦等[13]揭示三江黃牛與秦川牛、平武牛親緣關(guān)系較近。對mtDNA控制區(qū)進行分析顯示山西肉用綿羊和小尾寒羊聚在一起，與其他6個國內(nèi)外品種遺傳關(guān)系較遠[14]。楊會國等[15]分析顯示在進化關(guān)系上和田羊與藏綿羊最近，這可能與它們在地理分布上距離較近有一定關(guān)系。韓旭等[16]研究發(fā)現(xiàn)家養(yǎng)綿羊至少有兩大母系起源。郭彥斌等[17]發(fā)現(xiàn)兩大母系起源中單倍型以亞洲A型為主，且摩佛倫羊?qū)χ袊胤骄d羊品種的起源與進化有較大 貢獻。

本試驗根據(jù)mtDNA的遺傳特性，通過PCR擴增和基因測序的方法對甘肅高山細毛羊、歐拉羊、杜泊羊、湖羊、小尾寒羊和蒙古羊的mtDNA進行多態(tài)性分析，以期了解它們的遺傳多樣性，為綿羊遺傳資源的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取甘肅高山細毛羊、歐拉羊、杜泊羊、蒙古羊、小尾寒羊和湖羊為試驗對象，試驗羊來源與數(shù)量見表 1。取其頸靜脈血5 mL，用EDTA抗凝，迅速送回實驗室，-20 ℃冷凍保存，備用。

表1 實驗動物信息Table 1 Experimental animal information

1.2 提取血液基因組DNA

采用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取基因組DNA并通過分光光度計與瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)量及濃度檢測。

1.3 PCR反應(yīng)

從GenBank(NCBI)中選取綿羊線粒體DNA序列(登錄號為KP 702285.1)，利用Primers 5.0軟件設(shè)計引物，上游引物：5′-AGCCAGTTGAACACCCCTAC-3；下游引物：5′-GACCCAGGTGCCTATATATTTACTTC-3′。預(yù)期擴增片段長度為1 422 bp，引物由金唯智有限公司合成。PCR擴增體系為20 μL。擴增程序為：預(yù)變性 94 ℃ 3 min；變性94 ℃ 30 s，退火66 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 90 s，35 個循環(huán)；總延伸72 ℃ 10 min。將檢測合格的PCR產(chǎn)物送至生物公司進行DNA雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測序結(jié)果利用MEGA 6.0軟件進行比對分析，堿基含量分析利用紐普生物在線軟件(http://www.novopro.cn/tools/dna_stats.html)進行；運用DnaSP對mtDNA D-loop區(qū)序列進行單一多態(tài)位點、簡約信息位點、單倍型多樣度(Haplotype diversity,Hd)、核苷酸多樣度(Nucleotide diversity,Pi)、核苷酸平均差異數(shù)Kxy等遺傳參數(shù)分析。用MEGA 6.0構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊血液基因組DNA檢測及PCR產(chǎn)物擴增結(jié)果

采用DNA提取試劑盒從采集的綿羊冷凍血中提取基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示提取的基因組DNA無降解，并且分光光度計檢測OD值為 1.70～1.90。擴增產(chǎn)物大小與1 422 bp接近，符合目的片段大小，可以進行下一步試驗。

2.2 測序結(jié)果

運用NCBI BLAST將試驗綿羊序列與綿羊線粒體DNA標準序列(GenBank KP 702285.1)比對分析，結(jié)果顯示同源性達 99%以上，測序峰圖清晰可見，雜峰少，結(jié)合凝膠電泳檢測結(jié)果，可以確定擴增片段為目的片段。

2.3 D-loop序列分析

對D-loop區(qū)序列分析結(jié)果見表 2，6 個地方綿羊品種mtDNA D-loop區(qū)4 種核苷酸序列中歐拉羊G含量(15.77%)最高，蒙古羊C含量 (23.35%)最高，杜泊羊A含量(33.51%)和T含量(29.41%)均最高，但杜泊羊的G含量 (14.06%)和C含量(23.03%)最低。GC含量低于AT含量，表明綿羊D-loop區(qū)中A、T堿基較為富集，且D-loop區(qū)為高突變區(qū)，堿基突變類型包括缺失、轉(zhuǎn)換、顛換和插入，且堿基轉(zhuǎn)換頻率遠高于堿基顛換頻率。

表2 6 個地方綿羊品種mtDNA D-loop區(qū)核苷酸組成Table 2 Nucleotide composition of mtDNA D-loop region in 6 local sheep breeds %

2.4 遺傳多樣性分析

對6 個綿羊品種遺傳多樣性分析結(jié)果見表 3～5。共檢測到171 個變異位點，其中單一多態(tài)位點58 個，簡約信息位點113 個，單倍型為87 個。甘肅高山細毛羊和歐拉羊變異位點最多且相同，均為117 個；杜泊羊變異位點最少，有 65 個。從表 3 中可知，單一多態(tài)位點最多的是歐拉羊，最少的是杜泊羊。簡約信息位點最多的是甘肅高山細毛羊。歐拉羊、蒙古羊和湖羊單倍型多樣度相同且最高(Hd=1.000)，小尾寒羊單倍型多樣度最低(Hd=0.933)。湖羊平均核苷酸差異度最大(K=31.622)，而杜泊羊最小(K=15.995)。核苷酸多樣度最高的是湖羊(Pi=0.023 48)，最低的是杜泊羊(Pi=0.011 93)。

表3 6個綿羊品種遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity index of 6 sheep breeds

如表 4 所示，6 個品種間蒙古羊與杜泊羊的核苷酸平均差異數(shù)Kxy最大，蒙古羊與歐拉羊核苷酸平均差異數(shù)Kxy最小，分別是 37.235 00和 22.126 32。同樣，蒙古羊與杜泊羊核苷酸歧異度Dxy最大，蒙古羊與歐拉羊的核苷酸歧異度Dxy最小。

表4 6個綿羊品種間核苷酸平均差異數(shù)和核苷酸歧異度Table 4 Average nucleotide differences and nucleotide diversity among 6 sheep breeds

由表 5 可知，分化系數(shù)越高說明品種間分化度越高，6 個品種間杜泊羊與歐拉羊遺傳分化系數(shù)最大，湖羊與蒙古羊遺傳分化系數(shù)最小。小尾寒羊與湖羊的Nm值最小(Nm=0.002 03)，歐拉羊與杜泊羊的Nm最大(Nm=0.543 16)。

表5 6 個綿羊品種間遺傳分化系數(shù)及基因流Table 5 Genetic differentiation coefficient and gene flow among 6 sheep breeds

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹和遺傳距離

由表 6 可知，小尾寒羊與湖羊的遺傳距離最近，為 0.007；歐拉羊與杜泊羊的遺傳距離最遠，為 0.039。歐拉羊與小尾寒羊和湖羊的遺傳距離均為 0.038。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明(圖 1)，6 個綿羊品種明顯分為2 個分支，湖羊與小尾寒羊先聚集在一起，然后與杜泊羊聚為一類；歐拉羊與蒙古羊先聚為一類，然后與甘肅高山細毛羊聚為一大類。

表6 6 個綿羊品種間遺傳距離Table 6 Genetic distance between 6 sheep breeds

3 討 論

mtDNA D-loop區(qū)進化速率較高，因此常用來研究種間遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。馮慧等[18]通過研究羚牛D-loop區(qū)發(fā)現(xiàn)，羚牛D-loop區(qū)一段序列的AT平均含量(56.3%)高于GC 含量(43.7%)。閆海龍等[19]對秦川牛線粒體 D-loop區(qū)的分析結(jié)果表明，D-loop區(qū)序列AT平均含量為 61.5%，GC含量為 38.5%。本研究通過對6 個綿羊群體的 D-loop區(qū)分析，結(jié)果表明D-loop區(qū)GC含量低于AT含量，表示D-loop區(qū)A和T堿基較為豐富，符合脊椎動物線粒體基因組中4 種堿基分布不均這一特點，與馮慧等[18]和閆海龍等[19]研究結(jié)果一致。

包鵬甲[20]對綿羊D-loop序列分析得出，單倍型比例在藏羊和甘肅高山細毛羊群體中較豐富，而在湖羊中較低。本研究中歐拉羊、蒙古羊和湖羊單倍型比率均為 100%，杜泊羊與小尾寒羊單倍型比率較低為 80%，甘肅高山細毛羊單倍型比率為95.83%，表示試驗羊D-loop區(qū)的單倍型較豐富。核苷酸多樣度(Pi)及單倍型多樣度(Hd)是衡量種群遺傳多樣性水平的重要指標，其數(shù)值越高說明種群或群體的遺傳多樣性越高[21]。研究表明，將Hd=0.5 ,Pi=0.005作為分界點，即單倍型多樣度(Hd)高于 0.5且核苷酸多樣度(Pi)高于 0.005，則該種群遺傳多樣性水平較高[4]。本研究中6個綿羊群體的核苷酸多樣度(Pi)均大于0.005，單倍型多樣度(Hd)均高于 0.5，表明這6個綿羊群體具有豐富的遺傳多樣性，且具有較大的適應(yīng)能力、生長能力和進化潛力，更容易開拓新環(huán)境。Liu等[22]研究顯示藏羊單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣度(Pi)和平均核苷酸差異度分別為 0.992、0.019和 19.635，本研究中歐拉羊的單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣度(Pi)和平均核苷酸差異度分別為 1.000、0.014 63和 19.629，這與Liu等[22]研究結(jié)果相近。羅玉柱等[23]研究表明，中國綿羊群體的單倍型多樣度在甘肅高山細毛羊、甘肅藏羊和小尾寒羊群體中較高，這與本研究結(jié)果一致。本研究中湖羊的單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣度(Pi)和平均核苷酸差異度均最高，因此在6 個綿羊群體中湖羊的遺傳多樣性最豐富。河南奶山羊、薩能奶山羊、關(guān)中奶山羊和伏牛白山羊單倍型多樣度(Hd)為 0.391～0.814，核苷酸多樣度(Pi)的為 0.000 35～0.004 64[24]；而本研究中6個綿羊群體的單倍型多樣度(Hd)為 0.933～1.000，核苷酸多樣度(Pi)為 0.011 93～0.023 48，相比較而言，本研究中試驗羊群體的遺傳多樣性更豐富。四川6 個地方綿羊群體單倍型多樣度(Hd)為 0.780～0.995，核苷酸多樣度(Pi)為 0.010 99～ 0.021 14，與本研究中6 個地方綿羊群體相比，甘肅地方綿羊群體遺傳多樣性更豐富[3]。

核苷酸歧異度Dxy是衡量群體多態(tài)程度的重要指標之一,其值越大,群體多態(tài)程度越高[25]。核苷酸歧義度Dxy在反映一個群體的mtDNA多態(tài)程度時比單純的單倍型間的平均遺傳距離精確[26]。本研究中核苷酸歧異度Dxy與核苷酸平均差異數(shù)Kxy結(jié)果相一致。蒙古羊和杜泊羊的核苷酸平均差異數(shù)Kxy最大，為 37.235 00；蒙古羊和歐拉羊的核苷酸平均差異數(shù)Kxy最小，是 22.126 32。王金文等[27]研究結(jié)果表明杜泊羊與小尾寒羊的核苷酸歧義度Dxy和核苷酸差異數(shù)Kxy分別是 0.061 8和 40.443 2，本研究結(jié)果相對較低，分別是0.021 20和 28.200 0，可能是地域環(huán)境不同造成這種差異。

基因流數(shù)據(jù)顯示，各個種間基因流均小于 1，表明品種間基因交流較弱，群體分化程度較大[28]。研究表明遺傳分化系數(shù)是反映遺傳分化程度的一個指標[29]。閆春梅等[30]認為0.25

Chen等[31]用NJ方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明所有家養(yǎng)山羊聚集在一起，所有綿羊親緣關(guān)系較近，其中藏羊與呼倫貝爾羊的遺傳距離較小，與其他羊種的遺傳距離較大，這可能與棲息地或生態(tài)環(huán)境境差異有關(guān)。本研究中小尾寒羊和湖羊的遺傳距離最近，說明小尾寒羊和湖羊親緣關(guān)系最近，這與王亞磊等[32]研究結(jié)果一致。韓旭等[16]研究發(fā)現(xiàn)，中國地方綿羊品種與引入綿羊品種的遺傳距離較遠，本研究中歐拉羊與杜泊羊遺傳距離最遠，為 0.039，這與韓旭等[16]研究結(jié)果基本一致。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，湖羊與小尾寒羊先聚集在一起，然后和杜泊羊聚為一類；歐拉羊與蒙古羊先聚為一類，然后與甘肅高山細毛羊聚為一大類，表明湖羊與小尾寒羊遺傳差異小，蒙古羊與歐拉羊遺傳差異小。由于甘肅高山細毛羊有蒙古羊和藏羊的血緣，所以甘肅高山細毛羊與歐拉羊和蒙古羊聚為一類[2]。杜泊羊是從國外引入的品種，而小尾寒羊和湖羊均起源于蒙古羊，但是蒙古羊和歐拉羊聚為一類；湖羊和小尾寒羊與杜泊羊聚為一類，其原因可能是品種在演變過程中存在基因參入或長期自然選擇、人工選擇和地域隔離使遺傳物質(zhì)發(fā)生改變。

4 結(jié) 論

本研究中甘肅高山細毛羊、歐拉羊、杜泊羊、蒙古羊、小尾寒羊和湖羊均具有豐富的遺傳多樣性，其中湖羊?qū)Νh(huán)境變化的適應(yīng)能力更強。杜泊羊與國內(nèi)綿羊品種存在較高的遺傳分化。6 個綿羊品種分為2 個分支，小尾寒羊與湖羊親緣關(guān)系最近，杜泊羊與歐拉羊親緣關(guān)系最遠。