魏霽桐，吳國麗，李慧敏，郭佳林，宋齊魯，張亞敏，牛 娜，王軍衛(wèi)，馬守才，張改生，朱 峰，宋瑜龍

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國家楊凌農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種中心/國家小麥改良中心楊凌分中心/小麥育種教育部工程研究中心/陜西省作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2.周至縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，陜西周至 710400)

小麥作為我國第三大主要糧食作物，其籽粒含有豐富的淀粉和蛋白質(zhì)，對維持人類生命活動(dòng)、保障身體健康和推動(dòng)社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展起到了至關(guān)重要的作用，培育并大面積推廣高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、廣適型小麥新品種仍是當(dāng)前小麥育種工作的重點(diǎn)[1]。小麥產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性等性狀均屬于質(zhì)量-數(shù)量性狀，受主效基因和微效基因共同調(diào)控，對于這些復(fù)雜的多基因控制的數(shù)量性狀來說，傳統(tǒng)的雜交育種方法很難將所有有利基因聚合到1個(gè)基因型后代中，因此加快小麥高配合力優(yōu)異種質(zhì)資源創(chuàng)新，配制雜交種，免去后代分離與選擇，實(shí)現(xiàn)多基因高效聚合，可能是推動(dòng)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、廣適小麥新品種選育進(jìn)程、突破現(xiàn)階段育種瓶頸問題的有效途徑[2]。目前，小麥雜種優(yōu)勢利用主要有三系途徑(不育系、保持系及恢復(fù)系)、光溫敏兩系途徑及化學(xué)雜交劑途徑[3]。其中，三系途徑主要存在不育基因轉(zhuǎn)換耗時(shí)、保持系與不育系制種分離費(fèi)工、恢復(fù)源狹窄等問題[4]；光溫敏途徑同樣存在光溫敏基因轉(zhuǎn)換耗時(shí)、花粉育性轉(zhuǎn)換臨界溫度受環(huán)境因素影響較大、育性不穩(wěn)定等問題[5]，這兩類雜種優(yōu)勢利用途徑一定程度限制了雜交組合的組配范圍，限制了強(qiáng)優(yōu)勢雜交組合出現(xiàn)幾率，不利于雜交小麥新組合的鑒選及規(guī)?；a(chǎn)和大面積應(yīng)用。與三系途徑和光溫敏兩系途徑相比，化學(xué)雜交劑途徑不受小麥基因型限制，可以直接誘導(dǎo)任意常規(guī)優(yōu)良品種(系)花粉敗育，作為母本大量組配雜交組合，具有親本選擇范圍廣、強(qiáng)優(yōu)勢組合出現(xiàn)幾率高、更換組合速度快等優(yōu)點(diǎn)[6]。因此，利用化學(xué)雜交劑誘導(dǎo)小麥花粉敗育，產(chǎn)生生理型雄性不育系，配制小麥雜交種可能是實(shí)現(xiàn)小麥雜種優(yōu)勢利用的最有效途徑之一。

化學(xué)雜交劑(chemical hybridizing agent，簡稱CHA)是用于誘導(dǎo)植物花粉敗育，但不傷及雌蕊和影響植物生長發(fā)育的一類化學(xué)藥劑[7]。SQ-1是我國自主研發(fā)的、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的一類新型高效噠嗪類小麥化學(xué)雜交劑，具有殺雄窗口期長、不受母本基因型限制等特點(diǎn)，且誘導(dǎo)花粉敗育率在95%以上，不傷雌蕊，異交結(jié)實(shí)率穩(wěn)定在85%以上，對推動(dòng)雜交小麥進(jìn)入生產(chǎn)、實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要作用[8]。前人在SQ-1誘導(dǎo)小麥花粉敗育機(jī)理方面做了大量研究，如：董 劍等[9]利用基因芯片技術(shù)對SQ-1誘導(dǎo)的雄性不育及其對照可育系花藥進(jìn)行了分析，結(jié)果在兩類材料中共發(fā)現(xiàn)2 052個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因 1 294個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因758個(gè)，通路分析表明，上述基因主要參與植物對逆境的響應(yīng)、多糖代謝和信號傳導(dǎo)等代謝途徑；李亞鑫等[10]對SQ-1誘導(dǎo)的不育系及其對照可育系花藥中交替氧化酶(AOX1)基因表達(dá)模式進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)與對照可育系相比，AOX1a在花藥單核期表達(dá)量最高，二核期表達(dá)量減少，但三核期略有上升，推測AOX1a的異常表達(dá)可能影響了花藥中的抗氰呼吸途徑，導(dǎo)致抗氰呼吸紊亂，最終引發(fā)花粉敗育；朱啟迪等[11]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對SQ-1誘導(dǎo)的小麥生理型雄性不育及其對照可育系單核期花藥進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與對照可育系相比，不育系中有 1 088個(gè)基因表達(dá)模式發(fā)生變化，通路分析表明，上述基因共涉及氨基酸代謝、核糖體組分、光合作用及氨基酸代謝、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、活性氧代謝等60個(gè)代謝通路。此外，又有學(xué)者從蛋白質(zhì)水平、DNA甲基化水平、泛素化修飾水平、代謝組學(xué)水平、生理生化代謝水平及細(xì)胞學(xué)水平對SQ-1誘導(dǎo)的花粉敗育機(jī)理進(jìn)行了系統(tǒng)深入研究，但其分子機(jī)理仍未解析清楚[12]。目前在小麥、百合、芝麻等作物上研究表明，植物內(nèi)源激素在雄蕊發(fā)育及育性決定中起著重要作用[13-15]，而有關(guān)植物內(nèi)源激素與SQ-1誘導(dǎo)的小麥生理型雄性不育花粉敗育之間的內(nèi)在關(guān)系尚未見報(bào)道。

因此，本研究擬以化學(xué)雜交劑SQ-1誘導(dǎo)的小麥生理型雄性不育系及其對照可育系的5個(gè)發(fā)育時(shí)期花藥為材料，研究不育系和可育系轉(zhuǎn)錄水平基因差異及內(nèi)源JA與ABA含量的變化，以期揭示小麥生理型雄性不育與內(nèi)源JA與ABA的關(guān)系，為在激素水平解析SQ-1誘導(dǎo)花粉敗育的生理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

供試小麥品種西農(nóng)1376及化學(xué)雜交劑SQ-1均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院張改生教授課題組提供。

西農(nóng)1376于2018年10月種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)作一站。翌年三月，待西農(nóng)1376發(fā)育至Feeke’s 8.5時(shí)期(旗葉抽出至倒二葉一半)，將材料分為兩組，一組用5 kg·hm-2的化學(xué)雜交劑SQ-1葉面均勻噴施，誘導(dǎo)雄性不育系，記為PHYMS-1376；另一組用等量清水噴施，作為對照可育系，記為CK-1376，其他管理同大田。待PHYMS-1376及CK-1376發(fā)育至四分體、單核早期、單核晚期、二核期和三核期時(shí)，依據(jù)表型分別采集對應(yīng)時(shí)期長勢一致的穗子放入冰盒，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，置于冰上，迅速剝?nèi)∥挥谒胫胁炕ㄋ幹糜诟蓛舻妮d玻片上，滴加1.5%醋酸洋紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，確定發(fā)育時(shí)期。隨后，冰上收集PHYMS-1376和CK-1376 兩個(gè)材料5個(gè)發(fā)育時(shí)期的花藥分別放入1.5 mL無酶離心管中，液氮速凍，放入-80 ℃冰箱保存、備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序

利用Trizol試劑分別提取PHYMS-1376和CK-1376 四分體、單核早期、單核晚期、二核期、三核期花藥RNA，隨后分別用NanoDrop 2000和Agilent Bioanalyzer 2100檢測其濃度和質(zhì)量，并對其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈和第二鏈cDNA，并進(jìn)行純化，加接頭，用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)量評估，隨后構(gòu)建cDNA文庫，委托百邁克生物科技有限公司利用IlluminaHiseqXten平臺測序，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 序列對比與差異基因表達(dá)分析

對原始Reads進(jìn)行過濾，去除低質(zhì)量的Reads，得到Clean Reads，并利用Tophat2軟件將其與指定的參考基因組進(jìn)行比對，得到Mapped Data，并基于Nr(NCBI non-redundant protein sequences)、Nt(NCBI non-redundant nucleotide sequences)、Pfam(protein family)、KOG/COG(clusters of orthologous groups of proteins)和Swiss-Prot(a manually annotated and reviewed protein sequence database)數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行功能注釋。按照每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的fragments標(biāo)準(zhǔn)完成基因定量，差異表達(dá)基因鑒定依賴于DESeq R 包(1.10.1)，篩選標(biāo)準(zhǔn)為 |log2(fold change)|≥1且FDR<0.05，P-value< 0.05。此外，基于Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫(http://geneontology.org)和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫(https://www.genome. jp/kegg/pathway.html)，分別利用GO seqR包和KOBAS 軟件對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集和KEGG 通路分析。使用GSEA(WWW.gsea-msigdb.org)的方法對JA及ABA信號通路基因進(jìn)行富集分析。

1.2.3 ABA含量的測定

分別取PHYMS-1376和CK-1376 四分體、單核早期、單核晚期、二核期、三核期花藥約 0.1 g，放入液氮預(yù)冷的研缽中磨碎，加入1 mL預(yù)冷的甲醇∶水∶乙酸(80∶20∶1)混合液，4 ℃浸提過夜；次日，8 000 r·min-1離心10 min，取上清液4 ℃保存，殘?jiān)眉状肌盟靡宜?(80∶20∶1)混合液0.5 mL浸提2 h，8 000 r·min-1離心10 min，取上清液，并將2次上清液混合，40 ℃條件下，氮?dú)獯蹈?。依次加?.5 mL石油醚萃取脫色3次，棄去上層醚相，用飽和檸檬酸將下層液pH調(diào)至2.8，之后用等體積的乙酸乙酯萃取3次，并將有機(jī)相用氮?dú)獯蹈?；甲醇定容?.5 mL，用0.22 μm濾器過濾，存于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶待測。Rigol L3000高效液相色譜儀用于檢測待測樣本ABA含量，首先用流動(dòng)相(甲醇∶1%乙酸水=50∶50)過Kromasil C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，待基線穩(wěn)定后，加樣檢測，進(jìn)樣量10 μL，流速0.8 mL·min-1，柱溫35 ℃，走樣時(shí)間30 min，紫外檢測波長254 nm，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 JA含量測定

分別取PHYMS-1376和CK-1376 四分體、單核早期、單核晚期、二核期、三核期花藥約0.1 g，用80%乙腈浸提過夜；8 000 r·min-1離心10 min，取上清液，氮吹儀上冰浴吹干；加入500 μL水復(fù)溶，石油醚脫色3次；用飽和檸檬酸將pH調(diào)節(jié)至2.5～3.0，充分混勻；再用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，氮吹儀吹干；加入200 μL乙醚∶甲醇(9∶1)溶液復(fù)溶，并加入20 μL的 2 mmol·L-1三甲基硅烷化重氮甲烷的正已烷溶液混勻，室溫放置30 min；加入20 μL的 2 mol·L-1冰醋酸正已烷溶液混勻，室溫放置30 min，冰浴氮?dú)獯蹈?；加?.5 mL甲醇，用 0.22 μm濾器過濾，存于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶待測。Rigol L3000高效液相色譜儀用于樣本JA含量檢測，首先用流動(dòng)相過KromasilC18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)等度洗脫，待基線穩(wěn)定后，加樣檢測，進(jìn)樣量10 μL，流速 0.8 mL·min-1，柱溫35 ℃，走樣時(shí)間40 min，紫外檢測器波長210 nm，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 ABA與JA通路相關(guān)基因的qRT-PCR表達(dá)分析

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和進(jìn)一步深入解析ABA與JA信號通路關(guān)鍵基因表達(dá)與SQ-1誘導(dǎo)的小麥生理型花粉敗育之間的關(guān)系，對與ABA信號傳導(dǎo)及JA信號傳導(dǎo)通路相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR定量分析。利用Premier 5設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1)，并以18 s基因作為內(nèi)參，引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系：模板(500 ng·μL-1)1 μL，上下游引物(μmol·L-1)各0.4 μL，2×RealStar Green Fast Mixture 10 μL，ROXⅡ0.4 μL，ddH2O補(bǔ)充至 20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；3次重復(fù)，置于Quant Studio 3 Real-time PCR System(Applied Biosystems,USA)內(nèi)，規(guī)范操作，溶解曲線參照默認(rèn)值?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算，數(shù)據(jù)用SPSS 19.0處理，采用One-Way ANOVA中LSD法進(jìn)行差異顯著性分析。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Primers used for real-time PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量檢測

取SQ-1誘導(dǎo)的西農(nóng)1376不育系及對照可育系四分體時(shí)期、單核早期、單核晚期、二核期、三核期花藥，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，共30個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。經(jīng)過質(zhì)控篩選，共獲得209.79 Gb 的Clean reads，且各樣本Q30≥85.02%，對比參考基因組，比對率在70.16%～78.75%之間(表2)，結(jié)果表明，所有試驗(yàn)樣本的測序質(zhì)量良好，可用于后續(xù)研究。

表2 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與對比效率Table 2 Transcriptome sequencing results and alignment efficiency

2.2 差異表達(dá)基因分析

分別比對不育系及其對照可育系5個(gè)發(fā)育時(shí)期花藥中基因表達(dá)數(shù)據(jù)，共獲得36 058個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因18 108個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因17 950個(gè)。其中，三核期差異表達(dá)基因數(shù)最多，有14 978個(gè)，上調(diào)基因6 728個(gè)，下調(diào)基因 8 250個(gè)，其他依是二核期、四分體時(shí)期、單核晚期、單核早期，分別有13 832、3 697、1 946、1 605個(gè)差異表達(dá)基因；繪制韋恩圖發(fā)現(xiàn)，不育系與其對照可育系五個(gè)發(fā)育時(shí)期花藥中所共有的差異表達(dá)基因數(shù)是97個(gè)(圖 1)。結(jié)果表明：SQ-1誘導(dǎo)小麥花粉敗育過程是一個(gè)復(fù)雜的多基因參與過程，差異表達(dá)基因數(shù)受花藥發(fā)育時(shí)期影響較大，且共有的97個(gè)差異表達(dá)基因參與了不育系各時(shí)期花藥發(fā)育及花粉敗育過程。

2.3 差異表達(dá)基因的GO功能注釋與KEGG和GSEA富集分析

分別對PHYMS-1376及CK-1376四分體、單核早期、單核晚期、二核期、三核期差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每個(gè)發(fā)育時(shí)期的差異表達(dá)基因均與生物學(xué)過程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)有關(guān)，且生物學(xué)過程中細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)、代謝進(jìn)程(metabolic process)、單組織過程(single-organism process)，細(xì)胞組分中的細(xì)胞組成(cell part)、細(xì)胞(cell)、細(xì)胞器官(organelle)，分子功能中結(jié)合(binding)、催化活性(catalytic activities)等二級功能的基因富集比例較大。與之相比，在細(xì)胞組分中病毒(virion)、病毒組成(virion part)、膠原三聚體(collagen trimer)和分子功能中調(diào)節(jié)翻譯活性(translation regulator activity)和蛋白質(zhì)標(biāo)記(protein tag)等二級功能在不同時(shí)期差異表達(dá)基因中均未富集到，其他二級功能基因富集比率較低，差異較大。

對PHYMS-1376及CK-1376四分體、單核早期、單核晚期、二核期、三核期花藥各時(shí)期差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三核期花藥差異表達(dá)基因富集到代謝通路上的數(shù)目最多，有2 518個(gè)，其次是二核期、四分體時(shí)期、單核晚期、單核早期，分別有2 313、661、387、323個(gè)差異表達(dá)基因富集到代謝通路。此外，比較分析各時(shí)期富集差異表達(dá)基因數(shù)最多的前9位通路，發(fā)現(xiàn)植物激素信號傳導(dǎo)(plant hormone signal transduction)、苯丙素生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)、淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism)、氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)4個(gè)通路在PHYMS-1376及CK-1376花藥5個(gè)發(fā)育時(shí)期均能富集到差異表達(dá)基因，且植物激素信號傳導(dǎo)(plant hormone signal transduction)途徑在四分體時(shí)期富集到差異表達(dá)基因比例最高，約占四分體時(shí)期差異表達(dá)基因總數(shù)的16%，其次是單核早期、二核期、三核期、單核晚期，分別約占對應(yīng)時(shí)期差異表達(dá)基因總數(shù)的8%、6%、5%、4%。結(jié)果表明，SQ-1誘導(dǎo)小麥花粉敗育過程是一個(gè)復(fù)雜的多通路協(xié)同調(diào)控過程，且植物激素信號傳導(dǎo)(plant hormone signal transduction)、苯丙素生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)、淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism)、氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids )4個(gè)通路對引發(fā)花粉敗育可能起著至關(guān)重要的作用，其中植物激素信號傳導(dǎo)(plant hormone signal transduction)通路可能是引發(fā)后續(xù)其他通路差異表達(dá)基因變化的 關(guān)鍵。

利用GSEA方法富集所有與植物激素信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因，并重點(diǎn)關(guān)注茉莉酸(JA)和脫落酸途徑(ABA)的相關(guān)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24個(gè)差異表達(dá)基因被富集到了JA通路(圖2-A)，23個(gè)差異表達(dá)基因被富集到了ABA通路(圖2-B)。對JA通路24個(gè)差異表達(dá)基因表達(dá)量熱圖聚類分析發(fā)現(xiàn)，ID為TraesCS2A02G506500、TraesCS2B02G534800、TraesCS4A02G007800、TraesCS4D02G296000的基因表達(dá)量顯著高于其他基因。對ABA通路23個(gè)差異表達(dá)基因表達(dá)量熱圖聚類分析發(fā)現(xiàn)，ID為TraesCS3A02G371800、TraesCS1A02G2159004的基因表達(dá)量顯著高于其他基因。與此同時(shí)，兩個(gè)通路的差異表達(dá)基因在各時(shí)期表達(dá)量存在顯著差異。

2.4 JA與ABA激素含量分析

利用高效液相色譜技術(shù)檢測PHYMS-1376及CK-1376花藥四分體至三核期花藥內(nèi)源JA和ABA含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CK-1376相比，JA含量在PHYMS-1376四分體花藥中顯著降低，至單核早期顯著升高，單核晚期又顯著降低，二核期顯著升高，三核期顯著降低(P< 0.05)；ABA含量在PHYMS-1376四分體至三核期花藥中含量均高于CK-1376，其中單核早期、單核晚期和二核期二者間ABA含量差異均顯著(P<0.05)。上述結(jié)果表明，PHYMS-1376各發(fā)育時(shí)期花藥中JA含量的異常波動(dòng)及ABA含量的顯著增加，可能與SQ-1誘導(dǎo)小麥花粉敗育緊密相關(guān)。

2.5 熒光定量PCR結(jié)果分析

對富集到的11個(gè)ABA通路的重要基因進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)基本一致(表3)。其中，ID為TraesCS1D02G271000的基因在CK-1376四分體至二核期花藥中表達(dá)量呈顯著增加趨勢，二核期最大，三核期則顯著降低。與CK-1376相比，該基因在PHYMS-1376四分體至三核期花藥中表達(dá)量均顯著降低，二核期表現(xiàn)尤為明顯，三核期表達(dá)量最高；TraesCS3B02G266200基因在CK-1376四分體至單核早期花藥中表達(dá)量顯著下降，單核晚期上升至最大值，至二核期再次顯著下降，且二核與三核期表達(dá)量無顯著差異。與CK-1376相比，該基因在PHYMS-1376四分體至單核早期花藥中表達(dá)量顯著升高，單核晚期顯著降低，且二核和三核期表達(dá)量與對照無顯著差異；TraesCS2A02G493800基因在CK-1376四分體至二核期花藥中表達(dá)量較低，且差異不顯著，至三核期顯著增加到最大值。與CK-1376相比，該基因在PHYMS-1376四分體至三核期花藥中表達(dá)量均顯著增加，且四分體至單核晚期持續(xù)下降，二核期略有回升，至三核期增加至最大；TraesCS4D02G210900及其等位基因TraesCS4B 02G210100在CK-1376四分體至單核早期表達(dá)量呈顯著降低趨勢，單核晚期顯著增加至最大值，二核期顯著下降，三核期顯著升高。與CK-1376相比，上述兩個(gè)基因的表達(dá)量在PHYMS-1376四分體和單核晚期顯著降低，在單核早期、二核期和三核期顯著升高；TaABA8#OH1及其等位基因TraesCS6A02G271300和TraesCS6B02G298500在CK-1376四分體至單核早期表達(dá)量呈顯著增加至最大值，單核晚期至三核期上述3個(gè)基因表達(dá)量與單核早期相比均顯著降低，但單核晚期至三核期花藥之間以上3個(gè)基因表達(dá)量無顯著性差異。與CK-1376相比，上述3個(gè)基因的表達(dá)量在PHYMS-1376四分體和三核期顯著升高，而單核早期顯著降低，其余發(fā)育時(shí)期二者表達(dá)量無明顯差異；TaABA8#OH2及其等位基因TraesCS5A02G238000和TraesCS5B02G236500在CK-1376四分體至單核晚期表達(dá)量顯著降低至最小值，二核至三核期上述3個(gè)基因表達(dá)量顯著增加至最大值。與CK-1376相比，上述3個(gè)基因的表達(dá)量在PHYMS-1376四分體、單核早期和二核期顯著降低，而在單核晚期和三核期顯著升高。上述結(jié)果表明，與對照CK-1376相比，11個(gè)參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵基因的表達(dá)模式在PHYMS-1376花藥各發(fā)育時(shí)期均存在不同程度的差異，可能是不育系花藥中ABA含量紊亂的重要原因。

此外，對富集到的3個(gè)JA通路的重要基因進(jìn)行了定量分析，結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)基本一致。其中，TraesCS2A02G506500在CK-1376四分體至單核早期花藥中表達(dá)量呈顯著降低，單核晚期至三核期顯著增加至最大值。與CK-1376相比，該基因表達(dá)量在PHYMS-1376單核晚期花藥中顯著增加，二核期和三核期表達(dá)量顯著降低，在四分體至單核早期二者無顯著差異；TraesCS6B02G324300及其等位基因TraesCS6D02G274700在CK-1376四分體至單核晚期花藥中表達(dá)量極低，且無顯著差異，至二核期表達(dá)量顯著增加至最大值，三核期顯著降低。與CK-1376相比，上述2個(gè)基因的表達(dá)量在PHYMS-1376二核期至三核期顯著降低，其余各時(shí)期上述2個(gè)基因表達(dá)量與對照無明顯差異。上述結(jié)果表明，與對照CK-1376相比，3個(gè)參與JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵基因的表達(dá)模式在PHYMS-1376花藥各發(fā)育時(shí)期同樣存在不同程度的差異，可能是不育系花藥中JA含量紊亂的重要原因。

3 討 論

3.1 基因調(diào)控通路與作物雄性不育

SQ-1誘導(dǎo)的小麥生理型雄性不育與細(xì)胞質(zhì)雄性不育及光溫敏雄性不育相比，其花粉敗育機(jī)理更為復(fù)雜。Liu等[16]通過轉(zhuǎn)錄組測序的方法對5個(gè)同核異質(zhì)雄性不育小麥材料花藥進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，存在27 618個(gè)差異表達(dá)基因，主要涉及81條代謝通路，如：糖代謝、氧化磷酸化、苯丙烷生物合成和磷脂酰肌醇信號通路等。Ye等[17]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對K-TCMS不育系花藥進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，存在16 840個(gè)差異表達(dá)基因，主要涉及苯丙醇類生物合成、茉莉酸類生物合成及MYB轉(zhuǎn)錄因子等。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序?qū)Q-1誘導(dǎo)的小麥生理型雄性不育五個(gè)發(fā)育時(shí)期花藥進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各時(shí)期共存在差異基因36 058個(gè)，涉及100多個(gè)代謝通路，其中大多數(shù)基因參與植物激素信號傳導(dǎo)、苯丙素生物合成、淀粉和蔗糖代謝、氨基酸的生物合成等途徑。說明SQ-1誘導(dǎo)的小麥生理型雄性不育花粉敗育機(jī)理涉及的基因更多，通路更廣，分子機(jī)理更為 復(fù)雜。

3.2 ABA信號通路與作物雄性不育

作物內(nèi)源激素ABA含量變化與其雄性不育密切相關(guān)。Tang等[18]研究高溫誘導(dǎo)水稻花粉敗育機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，水稻花粉育性降低，且花藥中ABA含量與對照相比顯著升高。Ji等[19]研究干旱誘導(dǎo)小麥花粉敗育時(shí)發(fā)現(xiàn)，可以通過降低花藥中ABA含量恢復(fù)花粉粒育性，表明調(diào)控小麥內(nèi)源ABA可能會(huì)引起小麥生殖脅迫，進(jìn)而誘發(fā)其雄性不育。本研究測定了CK-1376和PHYMS-1376五個(gè)時(shí)期花藥中ABA的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照CK-1376相比，ABA含量在PHYMS-1376四分體至三核期花藥中含量均高于CK-1376，其中單核早期、單核晚期和二核期ABA含量均顯著高于對照(P<0.05)，上述結(jié)果表明，SQ-1誘導(dǎo)的小麥花粉敗育與花藥內(nèi)源ABA含量升高密切相關(guān)。上述結(jié)果同樣在Ding等[20]研究三個(gè)白菜胞質(zhì)雄性不育系中得到了 證實(shí)。

前人研究發(fā)現(xiàn)，PP2C、SnRk2蛋白與植物內(nèi)源ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)。植物內(nèi)源ABA可以與PYR/PYL蛋白復(fù)合體結(jié)合使PP2C失活性，進(jìn)而激活BIN2/BILs激酶，使SnRK2s磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游蛋白，進(jìn)一步促進(jìn)ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與合成，相反PP2C可以作為負(fù)調(diào)控因子使SnRK2s去磷酸化，激活其與其他靶蛋白互作，進(jìn)而抑制ABA信號傳導(dǎo)與合成[21-22]。本研究富集到PP2C的關(guān)鍵基因TraesCS1D02G271000，對其定量分析發(fā)現(xiàn)，該基因在CK-1376五個(gè)發(fā)育時(shí)期花藥中表達(dá)量均高于PHYMS-1376，且對照可育系五個(gè)發(fā)育時(shí)期花藥中ABA含量均低于PHYMS-1376。上述結(jié)果表明，SQ-1誘導(dǎo)小麥花粉敗育過程中，各時(shí)期花藥中PP2C關(guān)鍵基因TraesCS1D02G271000表達(dá)量過低，致使PP2C蛋白含量減少，進(jìn)一步激活BIN2/BILs激酶，使SnRK2s磷酸化，促進(jìn)ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與合成；另一個(gè)PP2C基因TraesCS3B02G266200定量結(jié)果表明，與對照CK-1376相比，四分體至單核早期，該基因在PHYMS-1376中的表達(dá)量顯著較高，單核晚期顯著低于對照，二核至三核期其表達(dá)量與對照無明顯差異。上述結(jié)果表明，不育系各時(shí)期花藥中TraesCS3B02G266200表達(dá)模式與ABA含量變化密切相關(guān)，但其表達(dá)模式不能完全支持PP2C蛋白負(fù)調(diào)控ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)理論，說明TraesCS3B02G266200基因有可能還參與其他代謝途徑。SnRK2s基因TraesCS2A02G493800定量結(jié)果表明，與CK-1376相比，該基因在PHYMS-1376四分體至三核期花藥中表達(dá)量均顯著較高。上述結(jié)果表明，TraesCS2 A02G493800的過量表達(dá)及磷酸化，可以調(diào)節(jié)下游蛋白，促進(jìn)ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與合成。這一研究結(jié)果在Yoo等[23]研究中也得到了證實(shí)。另兩個(gè)SnRK2s基因TraesCS4D02G210900及其等位基因表達(dá)模式也均支持SnRK2正向促進(jìn)ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)這一理論，但上述兩個(gè)基因的表達(dá)量在單核早期與這一理論相反，具體原因仍需要進(jìn)一步研究。

3.3 JA信號通路與作物雄性不育

JA是一類重要的植物激素，參與了眾多的生理調(diào)控過程，有大量的研究表明，JA與植物雄性不育密切相關(guān)。Keller等[24]篩選獲得一株dde2-2的擬南芥突變株，表型為雄性不育，但外源噴施茉莉酸甲酯會(huì)促使花粉育性恢復(fù)，鑒定后發(fā)現(xiàn)，該擬南芥突變體主要是AOS基因突變。Joon-Hyun等[25]利用基因敲除技術(shù)，將擬南芥AOS基因敲除，同樣獲得了擬南芥雄性不育表型株，且內(nèi)源JA含量非常低，但外施茉莉酸甲酯同樣可恢復(fù)其育性。Wang等[26]從雄性不育小麥中克隆出了茉莉酸合成途徑中重要差異表達(dá)基因TaOPR2，發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)模式可被外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)，表明TaOPR2與JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及此類型小麥花粉敗育密切相關(guān)。本研究檢測了CK-1376和PHYMS-1376五個(gè)發(fā)育時(shí)期花藥中JA含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CK-1376相比，JA含量在PHYMS-1376四分體、單核晚期及三核期花藥中顯著降低，在單核早期和二核期顯著升高(P<0.05)。上述結(jié)果表明，JA含量異常可能與SQ-1誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生花粉敗育密切相關(guān)，除此以外JA還有可能參與其他生理代謝過程。

前人研究發(fā)現(xiàn)，JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的激活主要由螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子MYC2(又稱JIN1)介導(dǎo)，當(dāng)JA含量水平高時(shí)，JAZ蛋白被激素降解，當(dāng)JA含量水平降低時(shí)，JAZ蛋白被激活，從而結(jié)合MYC2并且抑制其活性，之后MYC2再影響其他JA通路基因，且JA含量與JAZ相關(guān)基因表達(dá)之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)[27-28]。本研究富集到JAZ基因TraesCS2A02G506500，定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照CK-1376相比較，該基因表達(dá)量在PHYMS-1376單核晚期花藥中顯著增加，二核期和三核期表達(dá)量顯著降低，在四分體至單核早期表達(dá)量與對照無顯著性差異，推測TraesCS2A02G506500參與了JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但JA含量可能受TraesCS2A02G506500與其他基因共同調(diào)節(jié)；此外，另外2個(gè)JAZ基因TraesCS6B02G324300及其等位基因TraesCS6D02G274700表達(dá)量與CK-1376相比，在二核期這2個(gè)基因表達(dá)模式與JA含量呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)JA含量與JAZ基因表達(dá)之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)這一結(jié)論。Cui等[29]研究發(fā)現(xiàn)，SA(水楊酸)的重要復(fù)合物EDS1(enhanced disease susceptibility 1)可以與PAD4結(jié)合形成異二聚體，從而抑制MYC2活性，且MYC2被證明與JAZ相關(guān)基因表達(dá)呈負(fù)調(diào)控關(guān)系，但同時(shí)也被證實(shí)是JA合成途徑中的關(guān)鍵正調(diào)控因子。上述結(jié)果表明，植物花藥內(nèi)源JA含量異常變化，與花粉粒敗育密切相關(guān)，這一結(jié)果在Ye等[17]研究JA和MYB含量變化，誘發(fā)花粉壁不能正常形成，導(dǎo)致花粉敗育中得到證實(shí)。

4 結(jié) 論

與CK-1376比較，在PHYMS-1376五個(gè)發(fā)育時(shí)期花藥中共鑒定了36 058個(gè)差異表達(dá)基因，其中部分基因與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)性較高，檢測ABA和JA含量發(fā)現(xiàn)，ABA含量升高與SQ-1誘導(dǎo)的小麥花粉敗育密切相關(guān)，主要可能是因?yàn)椴挥蹈鲿r(shí)期花藥中PP2C關(guān)鍵基因TraesCS1D02G271000表達(dá)量過低，致使PP2C蛋白含量減少，進(jìn)一步激活BIN2/BILs激酶，使SnRK2s磷酸化，促進(jìn)ABA含量增加，進(jìn)而誘導(dǎo)花粉敗育。不育系PHYMS-1376花藥中JA含量及其相關(guān)基因的異常表達(dá)也可能是參與誘導(dǎo)花粉敗育的主要因素。