劉 玫，馬 豪，鄭學玲，李利民，劉 翀

河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001

抗凍蛋白(antifreeze proteins, AFPs)是一些生活在零度以下環(huán)境中的生物產生的抵抗冷凍威脅的蛋白，其能夠與冰晶結合從而修飾冰晶形態(tài)、降低溶液冰點、抑制冰晶重結晶，因此也被稱為冰結合蛋白。自20世紀60年代末在南極魚類的血液中發(fā)現了抗凍糖蛋白以來，在許多生物中已經發(fā)現了各種類型的AFPs[1]，其中植物AFPs與其他AFPs相比有著更好的抑制冰晶重結晶活性[2]，這可能是由于植物AFPs通常含有多個親水性冰晶結合域，似乎在吸附冰晶方面特別有效，從而在接近冰點的溫度或凍融條件下阻止水分子的遷移，控制冰晶生長[3-5]?；谶@個特性，植物AFPs在冷凍食品中有著很好的應用前景。

冷凍面團技術作為速凍發(fā)酵面制品的關鍵技術，具有工業(yè)化生產和質量標準化等優(yōu)越性，有利于烘焙行業(yè)連鎖經營模式的快速發(fā)展，能夠減少產品老化帶來的經濟損失，提高產品的新鮮度和安全性[6-7]。因此，冷凍面團技術具有巨大的發(fā)展?jié)摿ΑＨ欢?，冷凍面團在長期的運輸儲藏以及凍融過程中會經歷一系列的溫度波動，這會引起面團內部的冰晶生長和重結晶。有研究凍藏過程中冰晶重結晶會導致冷凍面團中主要組分產生劣變，并最終導致面團及其制品品質劣變[8-9]，如酵母細胞受到損傷、酵母活性降低，致使面團后期產氣能力不足[10-11]；面筋蛋白的網絡結構遭到破壞，致使面團持氣能力下降[12-13]；淀粉的顆粒形態(tài)遭到破壞，理化性質產生變化[14-15]，致使面團烘焙性能下降[16-17]等。

因此，在冷凍面團品質改良的研究中，抑制其內部冰晶重結晶是非常重要的。而植物AFPs有著很好的抑制冰晶重結晶效果，因此，對冷凍面團的改良效果顯著。作者綜述了近年來植物AFPs的特性研究及其在冷凍面團中的應用研究進展，以期為植物AFPs在速凍面制品中的應用提供指導。

1 植物AFPs概述

1.1 植物抗凍蛋白來源

自1992年首次發(fā)表關于植物AFPs的報告以來[18]，已在60多種植物中檢測到具有抗凍活性的蛋白，并提純分析了20余種(表1)。植物AFPs主要存在于越冬植物的葉片、種子、莖、根、樹皮等不同部位。不同植物AFPs的結構不相同，其抗凍活性也各有差異。

表1 不同植物的抗凍蛋白Table 1 Antifreeze proteins from different plants

1.2 植物AFPs的抗凍活性

植物AFPs的抗凍活性體現在3個方面，即：修飾冰晶形態(tài)、冰點熱滯效應、抑制冰晶重結晶性，其中抑制冰晶重結晶性最為突出[36]。

1.2.1 修飾冰晶形態(tài)

冰晶有很多晶體平面，主要分為基面和棱面[37-38]。而植物AFPs主要與冰晶的棱面結合，減緩此平面附近的生長，且為AFPs結合提供更多的靶平面，從而控制冰晶生長，修飾冰晶形成溫和的六邊形柱晶體[1]。

1.2.2 熱滯活性

與冰晶結合也是AFPs具有熱滯活性和抑制冰晶重結晶活性的原因。AFPs與冰晶結合從而使其冰點降低到平衡熔點以下，導致凍結滯后，產生熱滯效應[39]。植物AFPs熱滯值通常較低，可能是由于植物屬于耐凍物種，耐凍物種的AFPs主要作用可能是抑制冰晶重結晶，使細胞內外的冰晶保持較小，而不太可能是降低冰點[40]。因為冰點過低，過冷環(huán)境下會促進細胞內冰的形成以及快速、潛在的爆發(fā)式冰晶生長，導致細胞組織嚴重損傷，而在接近平衡冰點的溫度下凍結可以產生更高的存活率[41-42]。因此，植物傾向于低熱滯值，這可能允許更可控的冰晶生長[36]。這對于冷凍面團體系似乎也適用，控制面團內部冰晶生長，使冰晶保持細小均勻，能夠減少面團所受損害。

1.2.3 抑制冰晶重結晶活性

抑制冰晶重結晶活性是植物AFPs最顯著的優(yōu)勢。當植物的體液達到冰點時，由于非均質成核劑的存在，許多小冰晶在細胞外形成。隨著時間的推移，由于Ostwald熟化效應，大冰晶以小冰晶的減少為代價逐漸生長增大，稱為冰重結晶[1]。大冰晶的生長是有害的，即使它發(fā)生在細胞外，由于膜的機械損傷或脫水也會對細胞造成損傷[43-44]。而植物AFPs通常含有多個親水性冰晶結合域，能夠更有效地與冰晶結合，抑制冰晶生長且降低冰點，使冰晶不能聚集增大，從而產生顯著的抑制冰晶重結晶效果。且一般只需要極低質量濃度的植物AFPs，大約1 μg/mL，即可抑制冰晶重結晶，使冰晶保持細小均勻[45-46]。抑制冰晶重結晶活性的量化通?；谝种票е亟Y晶終點的計算。抑制冰晶重結晶終點是指仍然能阻止冰重結晶的AFPs的最低濃度。然而，抑制冰晶重結晶也可能是由AFPs以外的溶質引起的，因此，抑制冰晶重結晶分析通常在高濃度溶質(23%～30%蔗糖)下進行，以減少非特異性效應。根據以往研究，植物AFPs已經表現出最大的抑制冰晶重結晶活性，其中以黑麥草冰活性蛋白(IAP)的抑制冰晶重結晶終點最低(IAP3和IAP5為3 μg/mL，IAP2為0.6 μg/mL),其次為胡蘿卜AFP(1 μg/mL)、連翹 AFP(6 μg/mL)、沙棘 AFP(12 μg/mL)和D.antarctica(15.6 μg/mL)[46]。

2 植物AFPs作用機制

植物AFPs主要是幫助植物耐受低溫，而不是抵抗低溫，因此對于植物中的這些AFPs更準確的說法應該是冰結合蛋白，其通過與冰晶結合，直接參與冰晶的形成過程，從而直接保護植物免受低溫的影響[1]。不同來源的AFPs作用方式不同，目前提出的AFPs抗凍機制的假說有很多，如吸附抑制假說[47]、晶格匹配假說[48]、偶極子-偶極子假說[49]、剛體能量假說[50]、表面互補假說[51]等。其中吸附抑制假說很好地解釋了AFPs溶液冰點滯后的原因，但吸附抑制假說所暗示的AFPs與冰晶不可逆結合的概念表明，不同類型的AFPs的活性沒有差異，也沒有濃度依賴性[1]。然而，許多實驗表明，熱滯活性(TH活性)是有濃度依賴性的，通常與蛋白質濃度的平方根成比例，且相同濃度的不同類型AFP的TH活性不同[52-53]。因此，進一步的研究認為對于只結合棱面不結合基面的AFP，TH與其結合率和溶液蛋白濃度密切相關，因為當AFP與冰晶棱面結合并阻止其棱面生長后，晶體繼續(xù)在基面方向生長，直到形成雙錐形狀且尖端沒有暴露的基面，此時，冰晶停止生長，且任何進一步的潛在生長都被溶液中的AFP阻止，這個理論既符合不可逆結合，也符合TH活性的蛋白質濃度依賴性，但不適用于結合基面的AFP；對于結合基面的AFP，其TH活性并不直接依賴于溶液中AFP濃度，而與其表面濃度更相關[54-55]。

AFPs與冰晶結合是其具有抗凍活性的根本原因，不少研究者提出了AFPs與冰晶結合的模型為錨定籠形水模型[1,56]，即AFPs冰結合面的冰結合位點可能將水組織成一種約束的冰狀模型，類似于冰面附近的準液態(tài)水層，這兩層類似冰的液態(tài)層隨后會合并并變成冰，從而在低于熔點的溫度下將AFPs凍結在冰面上，導致不可逆吸附[57-58]。這阻止了水分子從準液態(tài)層進入冰晶晶格，從而抑制冰晶生長。這也可能“釘住”了冰晶表面，抑制了融化，從而抑制了冰晶重結晶[36]。但此機制對于植物AFPs是否適用還有待研究。并且不同來源的植物AFPs其結構具有顯著的多樣性，抗凍活性也不盡相同，而其結構與抗凍活性之間的關系還不甚清楚，因此未來研究需要探明植物AFPs抗凍活性與其結構的關系，從而更好地利用植物AFPs。

3 植物AFPs在冷凍面團中的應用研究

在冷凍食品行業(yè)，由于冷凍、解凍和溫度波動而造成的冰的生長和重結晶是導致產品質量下降的主要原因。因此,解決冰晶的生長和重結晶問題對于本行業(yè)的發(fā)展是至關重要的。冷凍面團是冷凍發(fā)酵面制品生產的關鍵技術，冰晶生長和重結晶會導致冷凍面團主要組分劣變并最終影響面團及其制品品質[9]。而植物AFPs具有很好的抑制冰晶重結晶效果，因此利用植物AFPs改良冷凍面團品質，具有其他改良劑所不具備的獨特優(yōu)勢。目前，植物AFPs對冷凍面團品質改良方面的研究也較多。

3.1 植物AFPs對冷凍面團中面筋蛋白的影響

面筋蛋白通過賦予面團黏彈性、持水性以及形成面筋網絡結構等對冷凍面團及最終產品的品質非常重要。然而，冷凍面團在凍藏過程中，面筋蛋白會發(fā)生解聚行為，使面團的黏彈性網絡結構受到破壞，影響冷凍面團及最終產品的品質[59]。添加冬小麥AFP[60]、燕麥AFP[61]能夠保護面筋網絡結構，改善面筋蛋白網絡中不規(guī)則空洞的形成，提高面筋蛋白的凍藏穩(wěn)定性。添加女貞葉AFP能夠有效抑制面團在-18 ℃凍藏期間面筋蛋白的脫水、α-螺旋減少、β-折疊和HMW/LMW增加，改善面團的流變性能[62]。燕麥AFP可以降低凍藏過程中冷凍面筋蛋白彈性模量和黏性模量的下降趨勢，保護面筋蛋白的α-螺旋和β-折疊結構免受冰晶損傷，保護面筋網絡結構[31,61]，且能夠減緩凍融處理對小麥面筋蛋白持水性、持油性和乳化穩(wěn)定性的影響[63]。另外由于天然植物AFP存在提取純化困難、成本高和產量低等不足，劉玫[9]利用畢赤酵母GS115重組生產胡蘿卜AFP(rCaAFP)，并研究了其對水合面筋在凍融循環(huán)過程中的理化性質的影響，研究發(fā)現rCaAFP減輕了GMP解聚作用，減輕了凍融循環(huán)對水合面筋二硫鍵、二級結構和微觀結構的破壞，保護了水合面筋在凍融循環(huán)過程中的流變特性，此研究從面筋蛋白的結構和功能方面對小麥面筋在冷凍貯藏過程中的劣化過程有更多的了解，為更好地利用rCaAFP保存冷凍面團提供理論依據。綜上所述，植物AFPs對冷凍面筋蛋白的結構以及流變學特性的影響的研究較多，而關于植物抗凍蛋白對面筋蛋白亞基、分子組成和功能特性的影響以及兩種蛋白之間是否存在相互作用的研究還鮮有報道，因此，接下來的研究應從這幾個方面更加全面深入地探明植物抗凍蛋白對冷凍面團中面筋蛋白的影響。

3.2 植物AFPs對冷凍面團中酵母活性的影響

冷凍面團在凍藏過程中，酵母的損傷和死亡最終會導致面團后期發(fā)酵能力不足，醒發(fā)時間長，且酵母損傷釋放的谷胱甘肽會損傷面筋網絡，導致面團持氣能力不足，最終導致面團及制品品質劣變，體積小。有研究表明面團經凍融后，酵母細胞菌落數顯著下降，酵母細胞谷胱甘肽釋放量呈上升趨勢，而添加黑麥草AFP[64]、女貞葉AFP[65]和胡蘿卜AFP[66]都能夠有效提高酵母的存活率，同時顯著減少酵母細胞谷胱甘肽的釋放量，減少面團中面筋蛋白的分解，從而有效改善冷凍面團產氣持氣能力。大麥籽粒AFP-1[32,67]和燕麥AFP[68]能夠通過降低冷凍及凍融循環(huán)對面團彈性模量及黏性模量的破壞，保護面團面筋網絡，同時降低冷凍及凍融循環(huán)對酵母產氣能力的破壞從而提高面團烘焙特性，保持面包品質。

3.3 植物AFPs對冷凍面團水分特性的影響

冷凍面團中水分含量、物理狀態(tài)及分布也對其品質至關重要，因為這與面團的醒發(fā)以及形成一個具有良好持氣性及面包孔隙結構的終產品有很大的關系[64,69]。面團經凍融和凍藏處理后，其可凍結水含量增多，并且水分流動性增大，面團中可凍結水含量會顯著影響面團的品質，可凍結水含量與凍藏期間面團中冰晶數量直接相關[70]，而冰晶是凍藏過程中淀粉面筋網絡結構遭到破壞的主要因素，因而凍藏過程中面團體系中可凍結水含量的多少對面團結構至關重要。有研究發(fā)現添加大麥籽粒AFP[32]、燕麥AFP[31]、黑麥草AFP[64]和重組胡蘿卜AFP[9]都能有效減緩冷凍面團含水率的下降，減弱凍融處理對水分遷移率的影響，降低面團的可凍結水含量，影響面團的水分分布，從而有效緩解面團凍藏過程中品質劣變，改善面團品質。

3.4 植物AFPs對冷凍面團烘焙特性的影響

冷凍面團在凍藏過程中主要組分的劣變會導致最終產品出現醒發(fā)時間延長、體積減小、口感變差、消費性下降等問題，這限制了冷凍面團的大規(guī)模應用。隨著凍藏時間的延長，面團醒發(fā)時間逐漸增加，在凍藏5周后，空白面團醒發(fā)時間由70 min增加至107 min，而添加女貞葉熱穩(wěn)定冰結構蛋白的面團醒發(fā)時間由70 min增加至99 min，表明添加植物AFPs能夠降低凍藏處理對面團醒發(fā)時間的延長，這可能是由于植物AFPs較好地抑制冰晶重結晶特性，減少了冰晶對酵母和面筋蛋白網絡結構的破壞，從而提高了面團發(fā)酵能力和持氣能力[71]。丁香麗等[32]研究發(fā)現大麥籽粒AFP也能顯著縮短冷凍面團醒發(fā)時間，劉玫等[9]研究了重組胡蘿卜AFP對冷凍面團醒發(fā)時間的影響也得到相似結果。由冷凍面團制得的面包和饅頭的品質劣變主要體現在比容的降低和質構性質的惡化。添加0.5%女貞葉熱穩(wěn)定冰結構蛋白能夠顯著增加冷凍面團面包的比容，在凍藏1、3、5周后，與空白面團面包相比，比容增加幅度分別達到3.22%、4.69%和5.02%[71]。大麥籽粒AFP也能夠顯著增加冷凍面團面包比容[32]，表明添加植物AFPs能夠降低凍藏對冷凍面團制品比容的不利影響。面包和饅頭的質構特性與其口感密切相關，冷凍面團饅頭的硬度隨著凍藏時間的延長呈增加趨勢，而在相同凍藏條件下，添加燕麥AFP的冷凍面團饅頭硬度較之顯著降低[31]。賈春利[71]研究發(fā)現，在凍藏5周后添加0.5%女貞葉冰結構蛋白的冷凍面團面包瓤比空白面團面包瓤軟化了12.1%，這可能是由于添加植物AFPs降低了冰晶對面團內部結構的破壞，使制品更松軟，硬度較小。凍藏處理會導致制品彈性、內聚力和回復性降低，而在添加重組胡蘿卜AFP后，其降低程度顯著減小[9]。

綜上可知，植物AFPs較好地抑制冰晶重結晶特性，能夠降低冰晶對冷凍面團各組分的不利影響，改善冷凍面團及其制品品質。

4 展望

冷凍面團在凍藏過程中由于溫度波動引起內部冰晶重結晶，會導致面團品質劣變，并最終影響制品品質，這限制了冷凍面團技術的發(fā)展。因此，抑制冷凍面團冰晶重結晶是其發(fā)展道路上亟須解決的問題，而植物AFPs具有較好的抑制冰晶重結晶特性，能夠很好解決這個問題，且AFPs無毒性，在多種食品中添加不會產生負面影響，其功能特性與任何毒性蛋白沒有關聯(lián)[72]。因此，植物AFPs將是克服冷凍面團技術瓶頸的關鍵因素。但是現如今對于植物AFPs作用機制、結構解析及開發(fā)應用的研究還較少，這就需要做進一步的研究，以便更好地利用植物AFPs改良冷凍食品品質。