吳 彤，蘭正蒼，劉志昌，楊 斌，段瑞雪，高笑欣，瞿洪洋，劉宏斌

0 引 言

甲狀腺癌(thyroid cancer,TC)是源于甲狀腺濾泡細(xì)胞或?yàn)V泡旁細(xì)胞的內(nèi)分泌相關(guān)的惡性腫瘤[1]。近年來(lái)，作為TC最常見的類型，甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)的發(fā)病率迅速增加[2]。世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)發(fā)布的全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示：2020年甲狀腺癌全球新增人數(shù)達(dá)59萬(wàn)，發(fā)病率占全球女性癌癥新發(fā)例數(shù)第5位；中國(guó)新增人數(shù)達(dá)22萬(wàn)，發(fā)病率占中國(guó)女性癌癥新發(fā)例數(shù)第4位[3]。臨床上大多數(shù)PTC患者的長(zhǎng)期預(yù)后總體較好；但一部分患者早期仍然發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。目前, 臨床上主要通過(guò)觸診、 超聲、 核素顯像及細(xì)針穿刺細(xì)胞活檢等方法對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)進(jìn)行評(píng)估,使甲狀腺癌診斷的準(zhǔn)確性有所提高, 但仍有10%～30%無(wú)法明確診斷[4]。早期精確診斷TC方法的探索用以干預(yù)甲狀腺腫瘤向惡性腫瘤的進(jìn)展過(guò)程具有重要意義[5]。從基因?qū)用娼沂炯谞钕侔┑陌l(fā)病機(jī)制，在早期辨別出TC高低風(fēng)險(xiǎn)，在明確診斷后對(duì)患者進(jìn)行個(gè)體化管理，避免過(guò)度醫(yī)療，形成標(biāo)準(zhǔn)化、合理化、個(gè)體化的治療模式[6]。

組織激肽釋放酶家族(humankallikrein，KLKs)是一類具有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶活性的絲氨酸蛋白酶，由15個(gè)成員(KLK11-KLK15)組成，具有絲氨酸蛋白酶活性的物質(zhì)[7]。絲氨酸蛋白酶在刺激惡性腫瘤的細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)降解等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移與某些絲氨酸蛋白酶的異常表達(dá)有關(guān)，并可作為其預(yù)后指標(biāo)[8]。KLK3亦稱為前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen， PSA)，臨床上在前列腺癌的篩查中十分重要[9]。此外，KLK12據(jù)報(bào)道是乳腺癌的獨(dú)立和有利的預(yù)后標(biāo)志[10]。KLK11是該家族的成員之一, 研究表明KLK11在卵巢、前列腺、乳腺、肺、胰腺和結(jié)腸等癌組織中均有表達(dá)[11-13]。KLK11基因表達(dá)水平的診斷和預(yù)后潛力已有報(bào)道，如前列腺癌和卵巢癌等內(nèi)分泌相關(guān)的癌癥中[14]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于KLK11在甲狀腺乳頭狀癌上的研究報(bào)道甚少。本研究通過(guò)對(duì)PTC血清和組織中KLK11的檢測(cè)，探討KLK11在PTC的表達(dá)水平及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象回顧性分析我院普通外科行手術(shù)治療，臨床資料完整，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為甲狀腺乳頭癌的90例患者資料?；仡?0例甲狀腺乳頭癌患者術(shù)前1 d清晨空腹外周血以及40例健康對(duì)照者外周血，以及90例甲狀腺乳頭癌患者術(shù)后癌組織、匹配的癌旁正常組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前患者行頸部彩超檢查均發(fā)現(xiàn)有甲狀腺結(jié)節(jié)并有手術(shù)指征；②術(shù)前未行放化療及其他任何抗腫瘤治療；③患者及家屬知情并同意本研究者；④術(shù)后病理進(jìn)一步證實(shí)為PTC患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有腫瘤病史或同時(shí)并發(fā)其他惡性腫瘤；②合并自身免疫性疾病、其他惡性腫瘤應(yīng)用放化療史；③基礎(chǔ)資料缺失，無(wú)法納入統(tǒng)計(jì)分析。本研究經(jīng)解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)(審批編號(hào)：2020KYLL146)。本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)注冊(cè)中心注冊(cè)通過(guò)審核(ChiCTR2000040341)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑和方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑研究所用試劑包括：人KLK11 ELISA試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司)；兔抗人KLK11多克隆抗體[愛必信(上海)生物科技有限公司]；即用型免疫組化 SP 試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；PBS 緩沖液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；檸檬酸組織抗原修復(fù)液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)PTC組和正常對(duì)照組血清中KLK11表達(dá)含量，繪制ROC曲線初步分析PTC患者血清中KLK11的診斷價(jià)值。

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)KLK11在PTC組織和匹配正常癌旁組織的表達(dá)水平，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)一步分析KLK11在PTC患者癌組織表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)關(guān)系。免疫組化結(jié)果判定：由2名病理科醫(yī)師采取雙盲法閱片。其中陽(yáng)性染色可被染成淡黃色或棕褐色不等。采用雙評(píng)半定量法進(jìn)行評(píng)分，陽(yáng)性染色腫瘤細(xì)胞的比例分級(jí)如下:0%為0分、1%～15%為1分、15%～45%為2分、>45%為3分；染色強(qiáng)度分級(jí)如下：0(無(wú)染色)、1(弱染色、淡黃色)、2(中等染色、黃褐色)、3(強(qiáng)染色、棕褐色)。染色指數(shù)計(jì)算如下:染色指數(shù)(SI) =染色強(qiáng)度×陽(yáng)性染色腫瘤細(xì)胞比例，染色指數(shù)：0分為陰性，1～12分為陽(yáng)性，<3分為低表達(dá)，≥3分為高表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 KLK11在PTC患者和正常對(duì)照患者血清中的表達(dá)根據(jù)ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PTC患者血清中KLK11含量(1 232.06±133.99)pg/mL，正常健康對(duì)照者血清中KLK11含量(1 029.45±137.29)pg/mL，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 ELISA法檢測(cè)PTC患者和正常對(duì)照者血清中KLK11的表達(dá)含量

2.2KLK11在PTC患者血清中的檢測(cè)意義以PTC患者為實(shí)驗(yàn)組和正常體檢者為對(duì)照組，繪制ROC曲線初步分析血清KLK11在PTC患者的診斷價(jià)值。KLK11的ROC曲線下面積為0.854(95%CI：0.783～0.925，P<0.001)，診斷價(jià)值較好,見圖2。由ROC曲線的結(jié)果得出KLK11對(duì)PTC診斷的臨界值為1 073.37 pg/mL，此時(shí)KLK11在PTC檢測(cè)中的敏感性87.78%、特異性70.00%。PTC組和正常對(duì)照組的陽(yáng)性率分別為87.78%和30.00%。

圖2 血清KLK11在PTC診斷的ROC曲線

2.3KLK11在PTC癌組織和配對(duì)正常癌旁組織表達(dá)水平根據(jù)免疫組化結(jié)果顯示，KLK11蛋白主要在PTC的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，見圖3。其陽(yáng)性率為72.22%(65例)，高于配對(duì)的癌旁正常組織中的21.11%(19例)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=47.232，P<0.05)。其中，KLK11在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腺外侵犯以及Ⅲ-Ⅳ期的PTC癌組織中為高表達(dá)，在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腺外侵犯以及Ⅰ-Ⅱ期的PTC癌組織中為低表達(dá)，見圖4。

2.4KLK11在PTC患者癌組織表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)關(guān)系PTC患者不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腺外侵犯以及TNM分期情況KLK11表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

a:PTC癌組織高表達(dá); b:癌旁正常組織無(wú)表達(dá)

a:淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織高表達(dá); b:淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移癌組織低表達(dá); c:腺外侵犯癌組織高表達(dá); d:腺外無(wú)侵犯癌組織低表達(dá); e:TNM Ⅲ～Ⅳ期癌組織高表達(dá); f:TNMⅠ～Ⅱ期癌組織高表達(dá)

表1 KLK11在PTC患者癌組織表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)關(guān)系

3 討 論

TC在全球范圍是常見的惡性腫瘤。近幾年，TC的發(fā)病率迅速增長(zhǎng)，成為公共衛(wèi)生的潛在威脅[15-16]。TC的發(fā)生發(fā)展主要受基因組變異的驅(qū)動(dòng)，包括腫瘤啟動(dòng)子基因的激活和腫瘤抑制基因的沉默[17-19]。目前，細(xì)針穿刺細(xì)胞活檢是甲狀腺結(jié)節(jié)臨床評(píng)估最準(zhǔn)確和最具成本效益的工具，美國(guó)甲狀腺協(xié)會(huì)強(qiáng)烈建議將其作為標(biāo)準(zhǔn)化臨床操作[20-22]。然而，10%～30%病例的細(xì)胞學(xué)結(jié)果具有不確定性，并被標(biāo)記為不確定的或可疑惡性腫瘤。在這些細(xì)胞學(xué)不確定的病例中，大多數(shù)患者接受了部分或完全甲狀腺切除術(shù)；而術(shù)后病理報(bào)告結(jié)果顯示只有6%～30%的細(xì)胞學(xué)不確定病例被確定為惡性，這使得臨床手術(shù)效率極低且非特異性，增加了患者的治療費(fèi)用[23-24]。分子生物標(biāo)志物可用于癌癥的診斷、預(yù)后、腫瘤分期、監(jiān)測(cè)對(duì)治療干預(yù)的藥物反應(yīng)，以及確定腫瘤復(fù)發(fā)或緩解[25]。因此，尋找一種在臨床上能夠早期精確區(qū)分甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的生物分子是十分必要的。使用腫瘤的分子特征來(lái)優(yōu)化外科和醫(yī)學(xué)治療正在成為許多腫瘤學(xué)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)，并且在甲狀腺結(jié)節(jié)和甲狀腺癌患者中具有巨大的潛力[26]。

KLKs(KLK1～KLK15)是一組分泌型絲氨酸蛋白酶，與多種癌癥密切相關(guān)，與腫瘤的增殖、遷移和侵襲等方面有關(guān)[27-29]。所有的KLKs均具有絲氨酸蛋白裂解酶的活性，并以一種級(jí)聯(lián)的方式相互激活，并激活其他的分子，并以這種方式參與腫瘤的發(fā)生[30]。KLKs在細(xì)胞發(fā)育和生理學(xué)中的生物學(xué)作用非常重要，因?yàn)樗鼈儏⑴c血壓調(diào)節(jié)、精血塊液化、組織重塑、肽激素加工和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[31]。在癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，KLKs能夠發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。在許多研究中，KLKs被證明具有腫瘤抑制劑的功能，KLK10在急性淋巴細(xì)胞白血病和乳腺癌中表現(xiàn)為下調(diào)[32-33]，而KLK3的下調(diào)可能與前列腺癌的侵襲性有關(guān)[34]。KLK6的上調(diào)在促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲中起重要作用[35]。另一方面，KLKs可能直接或間接通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)成分的重塑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的激活來(lái)調(diào)節(jié)惡性細(xì)胞的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致其惡性表型[36]。此外，KLKs可能通過(guò)與尿激酶型纖溶酶原激活劑、蛋白酶激活受體和基質(zhì)金屬蛋白酶等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互作用發(fā)揮作用，從而參與廣泛的分子網(wǎng)絡(luò)[37]。根據(jù)已完成最全面的表達(dá)譜，KLKs在人類多種組織和體液中存在，且具有不同程度的特異性[38]。KLK11是該家族的成員之一，位于染色體19q13.4上，是在人海馬體中首次發(fā)現(xiàn)的，之后證實(shí)其在多種組織中表達(dá)[39]。KLK11由上皮細(xì)胞分泌，免疫定位于核上區(qū)室，代表細(xì)胞的高爾基體。KLK11已被證明在腦、皮膚、唾液腺、胃、前列腺和腸等人組織中均有表達(dá)[40]。KLK11在耐藥細(xì)胞系中也高度表達(dá)，比如奧沙利鉑耐藥細(xì)胞。研究表明，敲除KLK11可通過(guò)阻斷PI3K/堿性磷酸酶信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)奧沙利鉑耐藥性[41]。KLK11在原發(fā)性鼻咽癌組織表達(dá)水平高于慢性黏膜炎癥的鼻炎組織，在復(fù)發(fā)的鼻炎癌組織表達(dá)水平也高于原發(fā)性組織[42]。

本研究通過(guò)ELISA法檢測(cè)了PTC患者和健康對(duì)照者血清中KLK11的表達(dá)含量，發(fā)現(xiàn)PTC患者血清KLK11含量增高，并且其對(duì)PTC的診斷也有一定價(jià)值。這與Xu等[43]人的研究報(bào)道是一致的，該團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)在138例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者血清KLK11高于健康對(duì)照者，血清KLK11與NSCLC的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等病理參數(shù)相關(guān)，使其成為肺癌診斷的潛在指標(biāo)。本研究又通過(guò)免疫組織化學(xué)法分析PTC癌組織和匹配癌旁正常組織中KLK11的表達(dá)水平，并且了分析KLK11表達(dá)水平與PTC患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，KLK11在PTC患者癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率增強(qiáng)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，且其表達(dá)水平與PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腺外侵犯及TNM分期相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明KLK11可能參與了PTC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程以及其惡性生物學(xué)行為。Diamandis等[44]研究發(fā)現(xiàn)血清KLK11在卵巢癌和前列腺癌患者中濃度升高,且在卵巢癌組織中KLK11定位主要出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。目前，在臨床上對(duì)PTC的診斷還沒(méi)有一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的生物分子標(biāo)志物，本研究顯示在PTC的血清和組織中，KLK11表達(dá)水平增強(qiáng)，這為以后PTC分子標(biāo)志物尋找提供了參考，當(dāng)然還需要進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等方法進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，KLK11在PTC患者血清和組織中表達(dá)增強(qiáng)，推測(cè)KLK11可能參與了PTC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，其高表達(dá)與PTC的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。本研究存在樣本量小且來(lái)自單中心，樣本數(shù)據(jù)不夠大，采取的實(shí)驗(yàn)方法只能從蛋白水平反映KLK11在PTC的診斷價(jià)值，缺乏基因?qū)用嬲{(diào)控的證據(jù)，需要進(jìn)一步更深層的研究。