劉 洋，柯 鏡，朱可心，鄧浩君，饒慧玲，于 娟，國宏莉，李 珊

0 引 言

肝是人體物質代謝的中心器官，具有強大的再生能力，增強肝的再生能力對肝疾病患者具有重要意義[1]。臨床上，部分肝切除術(partialhepatectomy，PHx)后的順利恢復主要取決于殘余肝的迅速再生以及肝功能的迅速恢復[2]。PHx后，除殘余成熟肝細胞迅速進入細胞周期進行增殖外，肝干細胞也迅速分化為肝細胞和膽管上皮細胞，參與肝再生[3]。多項研究表明，肝再生需要肝實質細胞與間質細胞共同參與，兩者進行復雜的內部交互協(xié)同[4-5]。但目前對肝再生的機制還不完全清楚。本研究旨在探討小鼠PHx后肝功能指標和不同時期肝增殖細胞的不同表達特征，探尋肝損傷后再生的動態(tài)評價指標，為臨床上肝代謝、急性肝損傷、肝腫瘤、肝再生以及肝移植等方面提供理論和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡12只，許可證號：SYXK(鄂2019-0031)，批號：00287628，飼養(yǎng)溫度18～24 ℃，相對濕度50%～60%，正常飲食，以肝左葉切除術后第2、4、8天為觀察時間點，隨機分為假手術組、術后2天、術后4天、術后8天組，各3只。手術操作均在 SPF級環(huán)境中完成。術前正常進食、進水，于手術當日分別稱取體質量并記錄，異氟烷吸入式氣體麻醉，麻醉滿意后將其固定在自制泡沫鼠板上，取腹正中切口，安爾碘消毒3遍，切口長約 2 cm，打開腹腔，用自制腹腔小拉先用1-0手術絲線集束結扎左外側葉肝蒂，切除左外側葉[6]。肝部結扎切除完成，檢查無出血后，以0號手術線迅速縫合腹部切口，并注射抗生素，術后小鼠蘇醒后確保其能正常進食、進水，定時觀察小鼠生存情況。本實驗經湖北醫(yī)藥學院實驗動物倫理委員會審查(批準號：00287628)。

1.2肝功能評估小鼠部分肝切模型建立后，于術后第2、4、8天處死小鼠，心臟取血進行血清學分析，同時收取正常未手術小鼠血樣標本作為正常組。用湖北醫(yī)藥學院附屬東風總醫(yī)院自動化生化分析儀測定谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、直接膽紅素(DBIL)、總膽紅素、甲胎蛋白水平。

1.3免疫組化(IHC)檢測于術后第2、4、8天處死小鼠，肝稱重后用10%中性甲醛固定，石蠟包埋用于進一步組織學分析。取石蠟包埋的肝組織切片5 μm用蘇木精和HE染色進行形態(tài)學檢查，用Ki67、性別決定區(qū)Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2, SOX2)、S100B評估肝增殖和肝干細胞再生情況。

1.4統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)用GraphPad 6.0進行分析，組間比較采用配對t檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 PHx小鼠肝大體形態(tài)變化結果顯示PHx后2、4、8天肝比重均未達到假手術組水平(P<0.05)。手術后2～4 d為肝比重上升的高峰期，術后4～8 d肝比重不再明顯增加，暗示PHx小鼠雖然能夠迅速啟動肝再生，但肝重不能在短時間內立即恢復至正常水平。另一方面，可觀察到在PHx后2 d，與肝左外側葉毗鄰的肝中葉表現(xiàn)出充血、增生。見圖1。

*P<0.05、**P<0.01

2.2PHx小鼠肝功能指標變化與假手術組相比，術后2天組ALT水平顯著升高(P<0.05)，但是呈現(xiàn)出較大的個體差異。與術后2天組比較，術后4天組、術后8天組快速下降至正常水平(P<0.05)。血清AST水平呈現(xiàn)出類似改變，均為術后第2天急速升高，術后4、8天較術后2天有明顯下降(P<0.01)，但是術后4天也呈現(xiàn)出一定的個體差異。而直接膽紅素在各組無顯著差異，且總膽紅素、甲胎蛋白含量均小于檢測范圍。與假手術組比較，術后2天組ALT/AST升高、AST/ALT降低(P<0.05)；與術后2天組比較，術后4、8天組ALT/AST降低、AST/ALT升高(P<0.05)。見表1。

表1 PHx小鼠部分肝功能指標

2.3PHx小鼠肝細胞增殖指標變化HE染色結果顯示，假手術組與術后2天，肝中央靜脈(central vein, CV)和門管區(qū)(portal vein, PV)區(qū)域形態(tài)結構規(guī)整，未見明顯異常；而術后4天組小鼠肝門管區(qū)可見較多炎性細胞浸潤，纖維組織輕度增生；術后8天組小鼠肝再生結束，肝細胞形態(tài)大小正常。IHC結果顯示， 假手術組小鼠肝正常增殖細胞(Ki67+)數(shù)為38.00±6.24，呈點狀分布。PHx后第2天，小鼠肝組織內Ki67+細胞數(shù)為143.00±14.18，增殖程度明顯高于假手術組(P<0.01)，增殖的細胞多散在分布于肝實質細胞中。術后第4天，除肝實質細胞外，增生的纖維組織細胞和浸潤的炎細胞Ki67+(345.00±50.02)，呈現(xiàn)出圍繞血管分布的特性，且與術后2天組相比有顯著增加(P<0.01)。術后第8天，細胞增殖恢復到正常水平，Ki67+細胞數(shù)為42.00±3.51，較術后2天組顯著下降(P<0.01)。見圖2。

圖2 PHx小鼠肝細胞增殖水平

2.4PHx小鼠肝組織SOX2、S100B表達變化IHC結果顯示，肝組織內的SOX2蛋白主要表達于PV區(qū)附近的肝細胞中，而CV周圍未見明顯分布。術后2、4天組，SOX2在PV區(qū)周圍肝細胞內強陽性表達，并且呈現(xiàn)出由PV區(qū)肝細胞向周圍肝細胞表達逐漸減弱的趨勢。另一方面，S100B則主要表達于肝細胞和膽管上皮細胞中。術后2天組可見PV區(qū)少數(shù)肝細胞與膽管上皮細胞內S100B弱陽性表達。而術后4天組S100B在肝細胞中的表達顯著升高，呈現(xiàn)出彌漫性強陽性表達。肝內小膽管增生顯著，膽管上皮細胞S100B的表達也有明顯上調。與假手術組比較，術后2天組SOX2、S100B表達增加(P<0.05)；與術后2天組比較，術后4天組SOX2、S100B表達增加(P<0.05)，術后8天組S100B表達減少(P<0.05)。見圖3，表2。

圖3 PHx小鼠肝組織SOX2、S100B形態(tài)(免疫組化染色)

表2 PHx小鼠肝組織SOX2、S100B平均表達強度

3 討 論

PHx是造成肝機械性損傷的一種方法，我們采用的C57BL/6小鼠肝部分切除模型，完整的保留了門靜脈主干、下腔靜脈、膽總管和肝動脈的結構，對肝既有機械性損傷，又有灌注損傷，接近于臨床肝移植手術過程，實驗結果更具有參考價值[6]。研究發(fā)現(xiàn)，行小鼠肝左外側葉切除術后，由于結扎左外側肝蒂，由于血流動力學變化，導致器官血流重新分配，臨近中葉首先發(fā)生代償性增生，與此同時，血清ALT、AST水平會發(fā)生明顯變化顯著升高(術后2 d)，但這一過程進展迅速，個體差異性較大。術后4～8 d，血清ALT、AST水平明顯下降，肝功能指標逐漸恢復至正常水平，但整個再生過程總膽紅素和甲胎蛋白的含量并無明顯改變。通過分析，我們認為單獨檢測ALT、AST能夠在一定程度上顯示肝功能的指標，但AST/ALT這一指標重復性最好，各組之間的差異更顯著，另外，結合本研究檢測肝細胞的增殖情況來看，AST/ALT更能夠反映肝的損傷與恢復程度。因此，當肝再生患者的ALT、AST指標差異較大時，臨床上可以使用AST/ALT來判斷該患者的肝功能，具有更強的指導意義。

肝再生的機制極其復雜，是一個由多條通路、多種因素共同參與的一種復雜的調控過程[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠PHx后0～2 d為肝再生的早期誘導階段，4～8 d是肝再生的晚期階段，此階段細胞發(fā)生凋亡和細胞增殖以維持再生肝的肝量。近年來的多項研究表明，肝竇內皮細胞有強大的再生能力，在晚期肝再生的過程中有著重要的作用[9-10]。Miyaoka等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PHx后肝實質細胞的再生在2 d后達到高峰，然后逐漸降低。而Hu等[12]研究表明，PHx后4 d，肝竇內皮細胞的增生達到高峰。這些均與我們的發(fā)現(xiàn)一致，肝再生的發(fā)生由肝實質細胞和非實質細胞(包括肝竇內皮細胞、Kupffer細胞和衛(wèi)星細胞等)共同參與，細胞兩者協(xié)同參與了PHx后的肝再生過程，在再生的初期階段(0～2 d)，以成熟肝實質細胞的增殖為主，在再生的晚期階段(4～8 d)，有內皮細胞、Kupffer細胞等多種非實質細胞共同參與增殖，這說明PHx后2～4 d為重要時間的截點，肝實質細胞和其他細胞可能在這一時間段扮演者不同角色，共同參與并加速肝再生的發(fā)生。

人胚胎干細胞 (human embryonic stem cell，hESC)是胚胎著床前的多能細胞在體外培養(yǎng)中形成的多能干細胞系，其具有兩大特性——無限自我更新和多能性[13]。干細胞重編程因子(Oct4、 Nanog、SOX2等)在hESC自我更新維持與分化過程中發(fā)揮決定性作用，其蛋白水平的高低直接影響hESC細胞的命運[14-15]。而在肝中，也存在著干細胞能夠轉化為兩種構成肝組織主體的細胞(肝細胞和膽管上皮細胞)并參與肝再生的過程。Bhave等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在施行大鼠PHx后，干細胞重編程因子(Oct4，Nanog，Klf4)在1 d后即出現(xiàn)顯著上調，并可能發(fā)揮著抗凋亡的作用，過表達/敲低干細胞重編程因子能夠影響肝再生的進程。我們的研究發(fā)現(xiàn)，PHx后，SOX2在PV區(qū)周圍肝細胞內強陽性表達，并且呈現(xiàn)出由PV區(qū)向周圍肝細胞表達逐漸減弱的趨勢，暗示著肝干細胞主要分布于PV區(qū)附近，當肝損傷發(fā)生后迅速啟動增殖，向成熟肝細胞進行分化，用于補充和代償肝組織損傷。

S100B表達異常在神經系統(tǒng)疾病及多種腫瘤中均有報道，具有廣泛的生物活性，在細胞增生、分化、基因表達、細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[17-18]。我們前期研究表明，S100B能夠調控血管損傷后的干細胞的分化，驅動干細胞向受損部位遷移[19]。還有研究發(fā)現(xiàn)，S100B的表達與腫瘤干細胞標志物(CD133，Nanog和Oct-4)的表達呈正相關[20-21]，S100B通過抑制P53誘導卵巢癌細胞具有類似干細胞特性，并誘導腫瘤耐藥發(fā)生[22]。而本研究顯示，S100B主要表達于門管區(qū)附近的肝細胞和膽管上皮細胞中，膽管細胞作為肝組織的主體細胞也能夠參與肝再生進程。PHx后4 d，肝內小膽管增生顯著，S100B在PV區(qū)附近的肝細胞和膽管細胞的表達均有明顯上調，而此時SOX2的表達在PV區(qū)臨近的肝細胞也有顯著增加，兩者的表達方式呈現(xiàn)出一致性，這一結果預示著S100B可能直接或間接參與了驅動肝再生過程中肝干細胞的增殖。

綜上所述，肝強大的再生能力是臨床上施行PHx和肝移植的病理生理基礎。本研究探究了PHx后肝再生過程中肝功能指標的變化規(guī)律，檢測了肝再生不同階段細胞增殖的特性，發(fā)現(xiàn)了SOX2和S100B陽性細胞可能在肝再生過程中發(fā)揮著重要的作用，但其具體作用機制仍需要進一步論證。本研究為促進肝再生、防治肝衰竭奠定一定的理論基礎和分子靶標。