曹 定，馬丹丹，羅思佳，張 翌，董慶泰，龔 齊，張智勇，蔡 遜

0 引 言

胃癌在所有癌癥中發(fā)病率排名第五位，是癌癥相關(guān)死亡的第三大常見原因[1-3]。幽門螺桿菌是胃癌的主要病因[4]，除幽門螺桿菌外，非賁門性胃癌的危險因素包括年齡大、社會經(jīng)濟(jì)地位低、吸煙、飲酒、家族易感、既往胃手術(shù)、惡性貧血等[5-7]。在日本和韓國等高發(fā)地區(qū)，篩查計劃的實行使胃癌相關(guān)死亡率大幅下降[8-10]。目前胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制還不明晰，深入探索胃癌的進(jìn)展機(jī)制，可以為胃癌的診療新思路提供依據(jù)[11]。134序列相似的家庭成員B (Family with sequence similarity 134, member B，F(xiàn)AM134B)，又名內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬受體1。FAM134B基因位于人類染色體5p區(qū)域，屬于FAM134基因家族成員，該家族成員還包括FAM134A和FAM134C共3個基因[12]。Tang于2001年在通過對比食管鱗狀細(xì)胞癌與癌旁組織的基因組雜交分析中首次發(fā)現(xiàn)FAM134B基因[13]，經(jīng)過多年的研究，F(xiàn)AM134B在多種惡性腫瘤中均起作用，其中包括食管鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和肝細(xì)胞癌[12，14-16]。其中FAM134B在食管鱗狀細(xì)胞癌中表現(xiàn)出原癌基因的特性，而在結(jié)直腸癌和乳腺癌中表現(xiàn)出抑癌基因的特性。于此同時，F(xiàn)AM134B的功能障礙在人類神經(jīng)病變[17]、病毒感染[18]、血管疾病[19]、炎癥[20]中發(fā)揮作用。但是FAM134B在胃癌中的具體作用機(jī)制尚未深入研究，本研究旨在研究FAM134B在胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)對胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，并通過分析FAM134B相關(guān)的信號通路及相互作用蛋白情況來對FAM134B生物學(xué)功能進(jìn)行闡述。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑pcDNA3.1-FAM134B、pcDNA3.1-vector由本單位中心實驗室提供，胃癌細(xì)胞系MFC由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供，胰蛋白酶、DMSO、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Sigma公司，離心管、質(zhì)粒提取試劑盒、Lopofectamin 2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國英杰公司，細(xì)胞板和培養(yǎng)皿購自美國康寧公司。

1.1.2主要儀器設(shè)備二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific)；流式細(xì)胞儀(碧迪醫(yī)療器械有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)型超凈工作臺(佳寶凈化工程設(shè)備有限公司)；熒光顯微鏡(奧林巴斯有限公司)。

1.2方法

1.2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染取MFC細(xì)胞系重懸后細(xì)致接種在無菌6孔板進(jìn)行培養(yǎng)，取Lopofectamin 2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染液室溫下5 min后輕緩混勻細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑；將DMEM液200 μL和pcDNA3.1-FAM134B質(zhì)粒4 μg 移入EP管中，輕輕混勻后室溫放置；將6 μL細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑滴加入EP管中，輕輕混勻后室溫下放置15 min；將上述含有pcDNA3.1-FAM134B的MFC細(xì)胞系(FAM134B組)滴加到6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；同樣方法于MFC細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-vector質(zhì)粒(對照組)，1 d后行蛋白印跡實驗評估質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況。

1.2.2細(xì)胞劃痕實驗分別用胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染成功的兩組細(xì)胞，在1000 r/min的條件下離心5 min；重懸計數(shù)后行細(xì)胞傳代，將兩組細(xì)胞移入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)直到單細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)孔；使用無菌槍頭對照直尺，沿培養(yǎng)孔的直徑垂直劃出1條直線，然后使用PBS緩沖液輕輕洗去刮下來的細(xì)胞；向培養(yǎng)板中加入DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后拍照記錄；運(yùn)用Image J軟件計算兩組細(xì)胞的愈合率。

1.2.3CCK8法用胰蛋白酶分別消化兩組細(xì)胞，在1000 r/min的條件下離心5 min。重懸計數(shù)后行細(xì)胞傳代。按每孔細(xì)胞數(shù)約為1萬個將兩組細(xì)胞移入在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后并向所有細(xì)胞孔中加入新配制的10%CCK8工作液(CCK8原液∶無血清培養(yǎng)基=1∶10)繼續(xù)培養(yǎng)。30 min后使用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處各孔的吸光度。每組6個復(fù)孔，兩組都重復(fù)試驗3次，記載每個復(fù)孔的光密度值。

1.2.4Transwell法將稀釋后1 mg/mL濃度的Matrige液50 μL均勻移入Transwell小室上室中培養(yǎng)2 h；用胰蛋白酶分別消化兩組細(xì)胞后離心，重懸計數(shù)后行細(xì)胞傳代。按每孔細(xì)胞數(shù)約為2萬個，將兩組細(xì)胞移入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。取出Transwell小室，向下室中加入含10%胎牛血清的DEME，向上室中加入兩組細(xì)胞懸液培養(yǎng)48 h。從培養(yǎng)箱中取出Transwell小室，使用無菌棉簽柔和吸干。將小室放入甲醛溶液中浸泡20 min固定，用PBS緩沖液洗滌后滴加結(jié)晶紫染色20 min，染色后用清水沖洗晾干。將處理完成的Transwell小室置入顯微鏡下觀察，每組4個復(fù)孔，隨機(jī)選取4個200倍視野進(jìn)行拍照記錄，每個視野細(xì)胞染色情況取平均值。

1.2.5Annexin V/PI雙染色法用胰蛋白酶分別消化兩組細(xì)胞后離心，取離心完成的EP管用移液槍棄去上清液，用提前預(yù)冷好4 ℃的PBS緩沖液沖洗2次。在冰面上向兩組細(xì)胞滴加1×Binding Buffer 300 μL。再向細(xì)胞中加入Annexin V-FITC 5 μL，輕輕充分混勻室溫下放置5 min后，加入Propidium Iodide 5 μL，充分搖勻后在避光的環(huán)境中室溫下放置10 min。使用凋亡試劑盒檢測兩組細(xì)胞凋亡情況，計算出均值后進(jìn)行統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)。

1.2.6FAM134B基因富集分析通過TCGA數(shù)據(jù)庫對FAM134B相關(guān)功能基因集進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，使用GSEA 4.0.2軟件進(jìn)行多重假設(shè)檢驗矯正，進(jìn)行隨機(jī)組合，對于P<0.05、FDR<0.05的基因集進(jìn)行篩選。

1.2.7利用String數(shù)據(jù)庫分析FAM134B相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)利用String數(shù)據(jù)庫分析FAM134B蛋白相互作用的蛋白情況，選取String數(shù)據(jù)庫中人類的FAM134B蛋白，對于FAM134B蛋白相互作用的蛋白進(jìn)行構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1FAM134B過表達(dá)對胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

2.1.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染蛋白印跡實驗評估質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，F(xiàn)AM134B組表達(dá)水平上升，轉(zhuǎn)染成功。見圖1。

1: FAM134B組;2：對照組

2.1.2FAM134B對胃癌細(xì)胞遷移的影響細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)AM134B組細(xì)胞24 h后的愈合率[(48.333±7.095)%]較對照組[(72.667±4.509)%]明顯降低(P=0.018)。表明FAM134B在一定程度抑制胃癌細(xì)胞的遷移。見圖2。

a:對照組；b：FAM134B組

2.1.3FAM134B對胃癌細(xì)胞增殖的影響CCK8法檢測實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)AM134B組A450nm波長的密度值(0.643±0.801)較對照組(1.071±0.783)明顯降低(P=0.008)。表明FAM134B在一定程度抑制胃癌細(xì)胞的增殖。

2.1.4FAM134B對胃癌細(xì)胞侵襲的影響Transwell法對細(xì)胞侵襲能力檢測實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)AM134B組細(xì)胞計數(shù)[(34.750±3.500)個]較對照組[(57.000±4.690)個]明顯降低(P=0.001)。表明FAM134B在一定程度上抑制胃癌細(xì)胞的侵襲。見圖3。

a：對照組；b：FAM134B組

2.1.5FAM134B對胃癌細(xì)胞凋亡的影響FAM134B組細(xì)胞凋亡計數(shù) [(22.240±2.487)個]較對照組[(12.553±2.155)個]明顯升高(P=0.007)。表明FAM134B在一定程度上促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。見圖4。

Q1:細(xì)胞機(jī)械性損傷、Q2：晚期凋亡或壞死細(xì)胞、Q3：細(xì)胞早起凋亡、Q4：存活正常細(xì)胞

2.2GSEA富集分析富集涉及178個基因集共56514個基因，隨FAM134B表達(dá)水平上升而上調(diào)包括102個基因集，且FAM134B主要參與32條信號通路(P<0.05，F(xiàn)DR<0.05)，包括氨基酸代謝、藥物代謝、視黃醇代謝、PPAR信號通路、初級膽汁酸生物合成等信號通路。與癌癥相關(guān)的生物過程和信號通路為色氨酸代謝通路、藥物代謝細(xì)胞色素P450通路、過氧化物酶體通路、PPAR信號通路。見表1，圖5。

表1 FAM134B相關(guān)富集分析結(jié)果

a：色氨酸代謝通路; b：藥物代謝細(xì)胞色素P450通路; c：過氧化物酶體通路; d：PPAR信號通路

2.3FAM134B相互作用的蛋白通過String數(shù)據(jù)庫分析FAM134B相互作用蛋白情況，發(fā)現(xiàn)與FAM134B蛋白相互作用的蛋白較多且相互作用分?jǐn)?shù)較大，其中相互作用分?jǐn)?shù)(Score)最大的為NAA50蛋白(Score=0.902)、WNK1蛋白(Score=0.759)、CTNND2蛋白(Score=0.718)、PLCXD2蛋白(Score=0.718)、WRB蛋白(Score=0.693)、MAP1LC3B蛋白(Score=0.675)、STX8蛋白(Score=0.647)、RASGEF1B(Score=0.641)、KIF1A蛋白(Score=0.609)、RTN3蛋白(0.604)。見圖6。

圖6 FAM134B相互作用蛋白圖

3 討 論

FAM134B蛋白的缺失會使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬功能不全，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能不全會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊蛋白的積累，最終這些因素會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中，F(xiàn)AM134B蛋白的低表達(dá)會導(dǎo)致饑餓過程中PAPP和CASPASE 9的積累加速，而CASPASE 8的水平?jīng)]有變化[17]，這表明FAM134B是可能一種影響線粒體通路的抗凋亡蛋白。自噬和細(xì)胞凋亡是兩種自毀過程，可以消除受損的細(xì)胞或細(xì)胞器[21]。自噬和凋亡的關(guān)系很復(fù)雜，在癌細(xì)胞株Hela和HCT116中，營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏會誘導(dǎo)細(xì)胞自噬來維持細(xì)胞生存。然而，在這種情況下抑制自噬會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。因此，F(xiàn)AM134B的消耗可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)吞噬抑制的結(jié)果，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。相反，降低FAM134B水平可減少結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[15]。因此，F(xiàn)AM134B誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能在不同的腫瘤中具有組織特異性。在其他生理環(huán)境下，自噬也可誘導(dǎo)一種細(xì)胞死亡，稱為自噬性細(xì)胞死亡(II型細(xì)胞死亡)。正常情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或UPR是觸發(fā)自噬的因素。然而，小分子z36誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)吞噬可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、UPR和細(xì)胞死亡[22]。在此過程中，F(xiàn)AM134B與LC3、ATG9一起被Z36上調(diào)，介導(dǎo)過度的ER吞噬，導(dǎo)致ER降解加速，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)受損[22]。結(jié)果表明，僅在Hela中過表達(dá)FAM134B就足以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞死亡[22]。FAM134B參與了I型和II型細(xì)胞死亡過程。FAM134B對細(xì)胞死亡的影響可能是由這兩種對立通路在不同情況下的凈平衡決定的，并可能與癌癥類型有關(guān)。

本研究通過構(gòu)建FAM134B過表達(dá)模型進(jìn)行體外實驗的方式，細(xì)胞劃痕實驗的結(jié)果顯示，F(xiàn)AM134B上調(diào)可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；CCK8法對兩組細(xì)胞活力檢測實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)AM134B上調(diào)可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；凋亡試劑盒對兩組細(xì)胞凋亡水平實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)AM134B上調(diào)可以顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。進(jìn)一步對FAM134B的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，基于TCGA數(shù)據(jù)庫中收集與FAM134B相關(guān)基因集信息，利用GSEA軟件對FAM134B進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示：共有32條信號通路在FAM134B高水平表型處有富集，與腫瘤相關(guān)的生物過程和信號通路為色氨酸代謝通路、藥物代謝細(xì)胞色素P450、過氧化物酶體通路、PPAR信號通路等。其中色氨酸的代謝場所主要是位于小腸及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，于此同時色氨酸代謝在腫瘤細(xì)胞中十分活躍。色氨酸于腫瘤細(xì)胞中代謝產(chǎn)生犬尿氨酸，犬尿氨酸能抑制樹突狀細(xì)胞功能和激活A(yù)HR通路，進(jìn)而密切參與一些腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程[23]。FAM134B是否參與色氨酸代謝等信號通路參與腫瘤的進(jìn)展，還需要更多的實驗來具體分析FAM134B作用情況。String數(shù)據(jù)庫分析FAM134B相互作用蛋白情況，可以發(fā)現(xiàn)與FAM134B蛋白相互作用蛋白包括NAA50、WNK1、CTNND2、PLCXD2、WRB、MAP1LC3B、STX8、RASGEF1B、KIF1A、RTN3等。其中WNK1蛋白可以通過刺激腫瘤血管生成在內(nèi)的多種作用來促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[24]。WNK1通過激活TRPC6-NFAT通路促進(jìn)腎腫瘤進(jìn)展，WNK1表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的生成，同時也在肝細(xì)胞癌調(diào)節(jié)中起重要作用[25-27]。FAM134B在胃癌中的表達(dá)下調(diào)是否與WNK1等相互作用蛋白相關(guān)，還需要進(jìn)一步的研究來深入探索FAM134B相關(guān)的相互作用具體情況。

綜上所述，F(xiàn)AM134B表達(dá)上調(diào)可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。且FAM134B相關(guān)信號通路及相互作用蛋白密切參與腫瘤的進(jìn)展。隨著對FAM134B研究的不斷深入，F(xiàn)AM134B可能成為胃癌診療過程中重要的靶點。