馬 彥，冀 英，楊 靜，岑 雯，曹 雪，李佳娟，馮文莉

0 引 言

煙曲霉是免疫功能低下患者的主要致病真菌，其引起的侵襲性曲霉病死亡率居高不下。由于目前臨床治療藥物效果欠佳，尋找有效的抗真菌藥物一直是近年來研究的熱點[1-2]。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin，CaN)廣泛參與多種生物的基因表達(dá)和細(xì)胞活性，是煙曲霉菌絲生長和毒力所必需的關(guān)鍵性磷酸酶[3]，是FK506和環(huán)孢素的靶點，它協(xié)調(diào)了多種真菌病原體的生長、毒力和耐藥性，可作為新的抗真菌藥物作用靶點研究[4]。研究表明CaN在煙曲霉生長發(fā)育時主要定位于菌絲頂端和分隔處，且其定位同PxIxIT模序密切相關(guān)。CaN通過與該模序的相互作用，參與磷酸化/去磷酸化過程[5]。并且CaN亞基CnaA同下游cbpA相互作用也需要PxIxIT模序參與[6-7]。有文獻(xiàn)報道模擬PxIxIT模序設(shè)計類似化合物作為侵襲性曲霉病免疫抑制治療的潛在候選藥物[8]。鑒于PxIxIT模序的重要性，本課題組前期通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)KpsF基因中含有PxIxIT模序[9]，并通過KpsF基因敲除株的構(gòu)建發(fā)現(xiàn)該基因敲除對煙曲霉形態(tài)影響并不明顯，而在鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中影響CaN亞基CnaA的表達(dá)[9]。為更好地了解KpsF基因是否與含有PxIxIT序列的CaN類似，在煙曲霉生長定位中有一定作用，甚至是否可能成為新的抗真菌藥物靶點，本研究進(jìn)一步構(gòu)建KpsF基因熒光定位菌株和過表達(dá)菌株，明確該基因?qū)τ跓熐股L的具體影響以及對煙曲霉抗真菌藥物存在下的生長變化情況，更好地了解該基因在煙曲霉致病中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 菌株來源煙曲霉KpsF基因敲除株(ΔKpsF)為本課題組前期構(gòu)建[9]。包含有eGFP綠色熒光蛋白報告基因的pUCGH質(zhì)粒(攜帶pOtef過表達(dá)啟動子和潮霉素抗性基因)和煙曲霉轉(zhuǎn)化用菌株Ku80由美國杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心贈送。

1.2主要試劑及配置羧芐青霉素、潮霉素、兩性霉素B、FK506購自Sigma公司，溶壁酶購自Novozymes公司，質(zhì)粒DNA提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶均購自Thermo Fisher Scientific公司，T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司，E.coliDH5α購自Sangon Biotech公司，F(xiàn)V1000激光共聚焦顯微鏡購自O(shè)lympus公司，卡泊芬凈購自MerK公司，伊曲康唑購自Xian Janssen公司。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，5 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0用去離子水定容至1 L，高壓滅菌。20×鹽溶液：NaNO3120 g，KCl 10.4 g，MgSO47H2O 10.4 g，KH2PO430.4 g，加水至1 L，室溫儲存。GMM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1L)：20×鹽溶液50 mL，微量元素液1 mL，D-葡萄糖10 g，瓊脂15 g (1.5%)，pH值6.5。Osmotic培養(yǎng)基、Trapping緩沖液、STC溶液、PEG-CaCl2溶液見文獻(xiàn)[10]。

1.3KpsF基因熒光定位菌株構(gòu)建在煙曲霉Af293全基因組(www.aspergillusgenome.org)中通過生物信息學(xué)方法(DNASTAR MegAlign)查找到KpsF基因，并對其基因序列進(jìn)行分析[5]。采用Primer3軟件設(shè)計引物KpsF-KpnI-F、KpsF-BamHI-R擴(kuò)增KpsF全基因，引物KpsF-term-SbfI-F、KpsF-term-HindIII-R擴(kuò)增其下游側(cè)翼序列約1.0 kb大小片段。PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：10 μmol/L 上、下游引物各2.5 μL，基因組DNA(200 ng/μL) 2 μL，Phusion DNA polymerase 0.5 μL，余試劑按照試劑盒用量補足。反應(yīng)條件：98 ℃ 5 min；98 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃ 90 s，共35循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。使用KpnI/BamHI將1.4 kb KpsF全基因與pUCGH質(zhì)粒相連，并將PCR擴(kuò)增的大約1.0kb的KpsF基因下游(KpsF-term)片段使用限制性內(nèi)切酶SbfI和HindIII克隆入以上構(gòu)建好的質(zhì)粒以獲得熒光定位轉(zhuǎn)化質(zhì)粒載體。質(zhì)粒的克隆連接體系為20 μL：包括載體DNA 1.8 μL，插入片段DNA 3.8 μL，5×RLB 4 μL，滅菌水9.4 μL，T4 DNA連接酶1 μL。連接步驟：22 ℃連接15 min后立即放在冰上，加入50 μL DH5α，冰上孵育30 min，42 ℃熱休克1 min，后立即放在冰上10 min，取出SOC，室溫放置，10 min后加入200 μL的SOC在37 ℃，250 r/min搖床震蕩30～60 min。將菌液在加有羧芐青霉素的LB平板上涂板，37 ℃過夜培養(yǎng)。將構(gòu)建好的熒光定位質(zhì)粒載體進(jìn)行測序，確保KpsF基因序列正確后使用KpnI進(jìn)行酶切，將酶切片段，采用原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化煙曲霉Ku80獲得KpsF基因熒光定位菌株，具體操作方法參照文獻(xiàn)[11]。實驗中用引物見表1。

1.4KpsF基因過表達(dá)菌株構(gòu)建采用軟件設(shè)計含有BamHI限制性內(nèi)切酶位點的引物KpsF-BamHI-F、KpsF-BamHI-R以1.3中構(gòu)建熒光定位質(zhì)粒載體為模版進(jìn)行擴(kuò)增KpsF基因。將其克隆連接入pUCGH質(zhì)粒(質(zhì)粒有pOtef啟動子，可以控制KpsF基因過表達(dá))。將該質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化煙曲霉Ku80[11]，即可得到KpsF基因過表達(dá)菌株。實驗中用引物見表1。

表1 構(gòu)建煙曲霉KpsF基因熒光定位和過表達(dá)質(zhì)粒載體以及驗證用引物

1.5多種PCR聯(lián)合驗證構(gòu)建菌株熒光定位菌株驗證使用三對引物(引物分別定位于eGFP，潮霉素以及KpsF基因等不同位置)來進(jìn)行驗證，具體引物配對及擴(kuò)增片段大小見表2。過表達(dá)菌株驗證使用兩對引物分別定位于eGFP和KpsF基因來進(jìn)行驗證。具體使用引物及擴(kuò)增片段大小見表3。

表2 多種PCR驗證煙曲霉KpsF基因熒光定位菌株用引物及相對應(yīng)擴(kuò)增片段

表3 使用不同引物對煙曲霉KpsF基因過表達(dá)菌株驗證

1.6光學(xué)顯微鏡觀察菌株形態(tài)學(xué)變化將KpsF過表達(dá)菌株、 Ku80和ΔKpsF菌株在GMM培養(yǎng)基上活化，并收集過濾孢子菌懸液。取10 μL 1×106個/mL孢子懸液點種于GMM固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中央，37 ℃培養(yǎng)，每24小時記錄菌落直徑，實驗重復(fù)3次。3 d后拍照并挑取菌落顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.7激光共聚焦顯微鏡觀察KpsF基因定位情況將轉(zhuǎn)入eGFP報告基因的熒光定位煙曲霉菌株37 ℃培養(yǎng)3 d，收集并過濾孢子菌懸液，血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行定量，取10 μL 1×106個/mL孢子懸液，將其加入到10 mL GMM液體培養(yǎng)基中，輕柔顛倒混勻，倒入平皿；75%乙醇清潔蓋玻片，過火滅菌后將其沉底于培養(yǎng)皿中，于37 ℃孵箱培養(yǎng)；分別于5 h、6 h和16 h時間點將蓋玻片取出，放置于載玻片上，使用激光共聚焦顯微鏡觀察，并拍照。

1.8菌株在含有不同抗真菌藥物培養(yǎng)基中生長情況選取卡泊芬凈、伊曲康唑、兩性霉素B、FK506，配制不同濃度GMM培養(yǎng)基，將煙曲霉Ku80、ΔKpsF和過表達(dá)菌株活化，用Tween20等滲鹽水沖洗，吸取孢子懸液并過濾，調(diào)節(jié)其濃度至1×106個/mL，取10 μL孢子菌懸液將其點種于平皿中央，在37 ℃孵箱培養(yǎng)72 h，每日測量記錄菌落直徑并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 菌株構(gòu)建

2.1.1 構(gòu)建KpsF基因熒光質(zhì)粒載體將KpsF基因同綠色熒光蛋白eGFP成功連接為轉(zhuǎn)化質(zhì)粒載體，見圖1。將該質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化煙曲霉Ku80，共獲得1、2、3、4四株轉(zhuǎn)化子。使用PCR法對轉(zhuǎn)化子DNA進(jìn)行驗證。使用表2中引物I擴(kuò)增，可見在煙曲霉KpsF基因熒光定位菌株獲得1.5 kb的片段；使用引物II，在煙曲霉KpsF基因熒光定位菌株獲得1.0 kb的片段，而對照菌株Ku80由于不含有質(zhì)粒，故在引物I和引物II均無擴(kuò)增條帶；使用引物III在在煙曲霉KpsF基因熒光定位菌株獲得7.5 kb的片段，對照菌株Ku80只有2.4 kb片段，見圖2。

2.1.2構(gòu)建KpsF基因過表達(dá)菌株參照KpsF基因過表達(dá)菌株所用質(zhì)粒構(gòu)建模式圖獲得pOtef控制的KpsF基因過表達(dá)質(zhì)粒載體，見圖3。

a:質(zhì)粒pUCGH； b：使用限制性內(nèi)切酶KpnI/BamHI在質(zhì)粒pUCGH中將擴(kuò)增的KpsF全基因替換pOtef過表達(dá)啟動子，同eGFP相連；c：將KpsF基因下游片段連接入pUCGH質(zhì)粒潮霉素抗性基因下游構(gòu)成轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒載體

M:Marker; 1-4：分別為4個菌株

a：質(zhì)粒pUCGH；b：在pOtef下游連接有KpsF基因的轉(zhuǎn)化煙曲霉質(zhì)粒載體

使用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將該質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化煙曲霉Ku80，共獲得a、b、c、d、e五株轉(zhuǎn)化子。挑取該五株轉(zhuǎn)化子，PCR驗證基因組DNA。驗證使用表3引物I：pUCGH-F和pUCGH-R進(jìn)行驗證，在KpsF基因過表達(dá)菌株可擴(kuò)增出1.6 kb(該對引物分別在質(zhì)粒pUCGH上游的pOtef和下游的eGFP上)的片段，而在 Ku80 則擴(kuò)增出234 bp片段。使用引物II：pUCGH-F和KpsF-BamHI-R進(jìn)行驗證，在過表達(dá)菌株可得到1.5 kb條帶，而在對照菌株Ku80未擴(kuò)增出條帶。見圖4。由以上電泳結(jié)果可見，兩對不同位置設(shè)計引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)化子，均擴(kuò)增出了相應(yīng)大小的片段，因此1、2、3、4、5這五株菌株都是煙曲霉KpsF基因過表達(dá)菌株正確的轉(zhuǎn)化子。

M:Marker; 1-5:分別為5株轉(zhuǎn)化子

2.2不同菌株的形態(tài)學(xué)觀察ΔKpsF和Ku80菌落大體形態(tài)觀察顯示此兩株菌均呈現(xiàn)毛絨狀，菌落中央輕微煙綠色，而平皿反面均為乳白色；而煙曲霉KpsF基因過表達(dá)菌株菌落直徑較Ku80和煙曲霉ΔKpsF明顯縮小，菌落致密緊縮，絨毛舒展較差，菌落表面皺褶較深，菌落中央呈現(xiàn)明顯的深綠色，平皿反面呈白色，有放射狀裂紋。低倍顯微鏡下觀察可見：煙曲霉ΔKpsF和Ku80菌絲細(xì)長，舒展，菌絲分支角度約為45°；而KpsF過表達(dá)株菌絲排列致密，分枝繁多，菌絲短，分枝角度大于45°。高倍顯微鏡下觀察可見：煙曲霉ΔKpsF和Ku80的分生孢子頭形態(tài)整齊，孢子頭柱狀，短小，有光滑梗壁；KpsF過表達(dá)菌株的分生孢子頭發(fā)育欠佳，孢子頭欠豐滿，頂囊的單層小梗不清晰。見圖5。KpsF過表達(dá)菌株菌落直徑較ΔKpsF和Ku80明顯降低(P<0.05)。見表4。

圖5 煙曲霉不同菌株普通顯微鏡下形態(tài)觀察結(jié)果(棉蘭染色)

表4 煙曲霉KpsF基因過表達(dá)菌株同Ku80、ΔKpsF菌落直徑比較

2.3煙曲霉KpsF基因熒光定位菌株的觀察煙曲霉處于孢子狀態(tài)時，綠色熒光蛋白均勻分布于整個細(xì)胞，當(dāng)孢子出現(xiàn)發(fā)芽時，綠色熒光蛋白也是彌漫分布于整個芽管。當(dāng)孢子發(fā)育成菌絲狀態(tài)后，可見綠色熒光蛋白在分隔處明顯聚集，在菌絲分支的分隔處也可見到。見圖6。

圖6 煙曲霉KpsF基因熒光定位菌株在孢子和菌絲狀態(tài)下綠色熒光蛋白分布情況

2.4三種菌株在含不同抗真菌藥物GMM培養(yǎng)基上的生長KpsF過表達(dá)菌株菌落直徑分別和卡泊芬凈、伊曲康唑、兩性霉素B濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.568、-0.743、-0.813,P=0.007、0.001、0.000)?？úǚ覂魸舛?1.0 μg/mL時，△KpsF、Ku80菌株菌落直徑分別和卡泊芬凈濃度呈正相關(guān)(r=0.927、0.915,P=0.000、0.001)；卡泊芬凈濃度<1.0 μg/mL時，△KpsF、Ku80菌株菌落直徑分別和卡泊芬凈濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.929、-0.923，P=0.000、0.000)?！鱇psF、Ku80菌株菌落直徑同伊曲康唑濃度分別呈負(fù)相關(guān)(r=-0.643、-0.645,P=0.004、0.004)?！鱇psF、Ku80菌株菌落直徑與兩性霉素B濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.888、-0.890,P=0.000、0.000)。

在含F(xiàn)K506的GMM培養(yǎng)基上，當(dāng)其濃度在0.02～5.0 μg/mL，所有菌株菌落直徑未見明顯增長或縮小，其中煙曲霉△KpsF和對照株Ku80的菌落顏色隨著FK506濃度從低逐漸升高，菌落顏色出現(xiàn)綠色，煙灰色再到乳白色這樣的變化，兩菌株菌落厚度出現(xiàn)變薄。煙曲霉KpsF過表達(dá)株在FK506濃度<0.05 μg/mL時，菌落顏色同煙曲霉△KpsF和對照株Ku80相似，濃度為0.1～5.0 μg/mL時，其菌落顏色變?yōu)辄S色。

3 討 論

CaN是一種鈣調(diào)素依賴性蛋白磷酸酶，參與真菌的形態(tài)發(fā)生，離子穩(wěn)態(tài)、毒性和應(yīng)激反應(yīng)等[13]。在煙曲霉中，CaN通過下游靶基因CrzA調(diào)節(jié)菌絲生長、細(xì)胞壁完整性，分生孢子形態(tài)，PO4-的轉(zhuǎn)運和致病性[13]。CaN催化調(diào)節(jié)亞基復(fù)合物在煙曲霉菌絲體中的定位和活性是煙曲霉菌絲體伸長和適當(dāng)分隔的關(guān)鍵[12]。PxIxIT模序是CaN重要的保守序列，參與CaN以上一系列的功能活動。我們通過使用eGFP作為報告基因的綠色熒光蛋白將其同含有PxIxIT模序的KpsF基因相連接，成功構(gòu)建了煙曲霉KpsF基因熒光定位菌株。利用質(zhì)粒pUCGH含有的pOtef過表達(dá)啟動子能直接轉(zhuǎn)化煙曲霉使基因過表達(dá)的特性構(gòu)建了煙曲霉KpsF基因過表達(dá)菌株。通過對煙曲霉ΔKpsF、Ku80和KpsF基因過表達(dá)菌株形態(tài)學(xué)觀察我們發(fā)現(xiàn)該基因敲除對于煙曲霉的形態(tài)影響不明顯，但該基因過表達(dá)，菌株會出現(xiàn)明顯縮小，生長受限。高倍鏡下觀察過表達(dá)菌株，其菌絲分枝較多，雜亂，且分支失去最常見的45o角。分生孢子頭明顯發(fā)育不良，說明該基因過表達(dá)明顯影響了煙曲霉的生長發(fā)育。既往有研究通過構(gòu)建CnaA定位菌株證實了CaN在煙曲霉生長中于菌絲尖端，分隔以及囊泡與芽體的連接處，推測CaN參與煙曲霉菌絲延長、隔膜形式和孢子發(fā)育[12]。為了解KpsF基因在煙曲霉生長中的定位，我們構(gòu)建了煙曲霉KpsF基因熒光定位菌株，通過觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)煙曲霉處于孢子狀態(tài)時，綠色熒光彌漫分布于整個細(xì)胞，但在孢子形成菌絲后，在菌絲的隔膜處有明顯的綠色熒光聚集，在其他結(jié)構(gòu)如菌絲頂端，囊泡等處未見到該熒光的聚集，這同CaN定位的有所不同，由此推測該基因可能只參與了菌絲分隔的形成。研究發(fā)現(xiàn)GMM培養(yǎng)基上，eGFP標(biāo)記的Hsp90主要分布于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)使用濃度不同的卡波芬凈處理時，Hsp90的定位出現(xiàn)了明顯的改變，表明了Hsp90在細(xì)胞壁壓力補償機制重要作用[14-15]。與此類似，前期我們發(fā)現(xiàn)KpsF基因參與了鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，因而推測在不同Ca2+濃度壓力下或者加入鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑FK506可能會影響KpsF基因的定位變化，這尚需進(jìn)一步實驗證明。

KpsF基因含有與CaN類似的PxIxIT模序，且CaN目前正作為可能的抗真菌藥物而成為研究熱點[2]，為了更好地了解KpsF基因?qū)熐箍拐婢幬锎嬖谙律L有無影響，我們觀察了不同類別抗真菌藥物卡泊芬凈、伊曲康唑、兩性霉素B存在下煙曲霉Ku80、ΔKpsF和過表達(dá)菌株的生長情況。在含有伊曲康唑和兩性霉素B的培養(yǎng)基上，這三株菌隨著藥物濃度的增加總體趨勢都是菌落直徑明顯縮小。此兩種藥物都作用于真菌細(xì)胞膜，根據(jù)目前的結(jié)果我們推測KpsF基因可能與真菌細(xì)胞膜的合成并無明顯相關(guān)或該基因同此兩種抗真菌藥物在真菌細(xì)胞膜的靶點無明顯相互作用。已發(fā)現(xiàn)棘白菌素類藥物作為常用的抗真菌藥物，隨著卡泊芬凈藥物濃度升高，抗真菌活力相對降低，稱之為矛盾生長，該現(xiàn)象是在使用卡泊芬凈治療白念珠菌感染時被發(fā)現(xiàn)的[16]。Wiederhold[17]使用相關(guān)的實驗研究證實了過量使用棘白菌素類藥物治療造成疾病復(fù)發(fā)增多同矛盾生長密切相關(guān)，在浮游生物和生物膜細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)也存在類似情況[18]。研究顯示構(gòu)建CaN催化亞基A缺陷株△CnaA和轉(zhuǎn)錄因子缺陷株△CrzA，通過使用較高濃度卡泊芬凈處理，觀察到煙曲霉的矛盾生長現(xiàn)象可能是由鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路控制的[19]。本實驗中，三株菌的菌落直徑在卡泊芬凈濃度小于1.0 μg/mL時都隨卡泊芬凈濃度升高呈現(xiàn)縮小趨勢；但是當(dāng)卡泊芬凈濃度大于1.0 μg/mL時(5.0 μg/mL，10 μg/mL)Ku80和ΔKpsF兩菌株菌落直徑反而較低濃度時增大，出現(xiàn)矛盾生長現(xiàn)象，過表達(dá)株未見到此種現(xiàn)象。我們推測煙曲霉KpsF基因可能是一種轉(zhuǎn)錄因子或者參與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路控制，從而導(dǎo)致出現(xiàn)矛盾生長現(xiàn)象。當(dāng)然這個推測還需要進(jìn)一步深入研究證實。FK506作為CaN抑制劑，主要在器官移植患者中使用較多。我們發(fā)現(xiàn)加入FK506的GMM培養(yǎng)基上所有菌株生長都明顯的被抑制，但菌落顏色出現(xiàn)不同，目前尚未有關(guān)于FK506如何影響煙曲霉菌落顏色的相關(guān)研究報道，出現(xiàn)這種現(xiàn)象還需要我們進(jìn)一步查找原因。

由上可見，雖然在KpsF基因含有同CaN類似的PxIxIT模序，但其在抗真菌藥物敏感性以及煙曲霉生長中的作用與CaN并不完全一致。本研究獲得了煙曲霉KpsF基因熒光定位菌株和過表達(dá)菌株，我們初步探索了該基因在煙曲霉生長中的可能作用，也使我們對PxIxIT模序在不同基因中扮演的角色有了更深入的了解，為進(jìn)一步研究鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路以及KpsF基因如何定位在菌絲隔膜等研究奠定了基礎(chǔ)。