沈俊逸，王東軼，蔡 輝，楊 帆，壯雨雯，商 瑋

0 引 言

缺血性腦卒中是指腦供血障礙造成相應(yīng)神經(jīng)功能損傷的臨床綜合征，具有高致死率和高致殘率的特點(diǎn)，造成了嚴(yán)重的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。促進(jìn)血管新生是缺血性腦卒中后功能恢復(fù)的關(guān)鍵治療策略[1]。腦卒中后的血管新生不僅可以改善局部缺血缺氧，還能通過分泌多種細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)突觸生長和神經(jīng)發(fā)生[2-3]。因此，血管新生是決定缺血性腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)及預(yù)后的重要因素。

人參皂苷Rg1是從人參中提取的有效成分，可以促進(jìn)血管新生，對缺血性腦卒中的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用[4]，但人參皂苷Rg1不具備主動作用靶組織或靶細(xì)胞的能力。新型納米載藥系統(tǒng)，即在納米顆粒的表面耦聯(lián)單克隆抗體OX26，能夠主動靶向性結(jié)合血腦屏障(blood brain barrier，BBB)中腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain capillary endothelial cells，BMECs)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，將其包裹人參皂苷Rg1后可以協(xié)助藥物靶向作用于BMECs，從而提高藥物的生物利用率[5]。本研究擬構(gòu)建單克隆抗體OX26修飾的納米顆粒，并用包裹人參皂苷Rg1的納米顆粒(Ginsenoside Rg1 -nanoparticles，Rg1-NPs)處理BMECs，觀察Rg1-NPs 對BMECs增殖、遷移和成管能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料青霉素/鏈霉素、胰酶、胎牛血清購自Hyclone公司，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)購自南京生興生物，MTT溶液購自beyotime公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自sigma公司，0.4%結(jié)晶紫染色液購自Solarbio公司，Transwell小室購自Millipore公司。

1.2方法

1.2.1 Rg1-NPs的制備本研究采用聚谷氨酸和苯丙氨酸乙酯共聚物制備。L-PAE與小分聚谷氨酸在酰胺化催化劑的作用下發(fā)揮酰胺化縮合，形成共聚物。共聚物與人參皂苷Rg1溶解混合在DMSO中，形成的納米顆粒通過離心進(jìn)行富集，再將上清中游離人參皂苷Rg1去除。Rg1-NP與單克隆抗體OX26(100 μg/mL)在酰胺化催化劑的作用下進(jìn)行耦聯(lián)，未耦聯(lián)的單克隆抗體OX26進(jìn)一步通過離心去除。

1.2.2檢測Rg1-NPs的微觀結(jié)構(gòu)和表征采用磷鉬酸染色法-透射電子顯微鏡觀察Rg1-NPs的微觀結(jié)構(gòu)。將納米顆粒溶液滴至碳膜銅網(wǎng)上，在烘片機(jī)上干燥，滴加磷鉬酸負(fù)染試劑再干燥。將樣本置于H-7000型透射電子顯微鏡下觀察并拍攝。將制備所得的Rg1-NPs采用激光納米粒度儀測定其平均粒徑、多分散指數(shù)以及Zeta電位。檢測Rg1-NPs的包裹率、泄漏率和體外緩釋實驗。

1.2.3MTT檢測Rg1-NPs對BMECs增殖的影響在培養(yǎng)的BMECs細(xì)胞中分別加入PBS(對照組)、Rg1(Rg1組)和人參皂苷Rg1納米顆粒(Rg1-NPs組)，培養(yǎng)6 h后，加入10 μL MTT(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)3 h。去除培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，搖晃均勻，在570 nm波長測定吸光度。

1.2.4嵌套小室方法檢測Rg1-NPs對BMECs遷移的影響在培養(yǎng)的BMECs細(xì)胞中分別加入PBS(對照組)、Rg1(Rg1組)和Rg1-NPs(Rg1-NPs組)，培養(yǎng)9 h后，加入約400 μL多聚甲醛，室溫固定10 min，吸干上室固定液，加入約400 μL 結(jié)晶紫染液，室溫染色10 min，輕輕用PBS浸泡數(shù)次以去除多余染料，擦去上室膜表面未遷移的細(xì)胞，放入顯微鏡下觀察并計數(shù)。

1.2.5小管形成實驗觀察Rg1-NPs對BMECs成管的影響在培養(yǎng)的BMECs細(xì)胞中分別加入PBS(對照組)、Rg1(Rg1組)和Rg1-NPs(Rg1-NPs組)，培養(yǎng)9 h后，觀察內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成情況并拍照。拍照后，使用ImageJ軟件Angiogenesis Analyzer Plugin對管腔形成情況進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0分析，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，以P≤0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Rg1-NPs的微觀結(jié)構(gòu)和表征透射電鏡結(jié)果顯示納米顆粒為橢圓形，激光納米粒度儀測定的結(jié)果顯示Rg1-NPs的平均粒徑為203.78 nm，多分散指數(shù)為0.135，Zeta電位為-23.13 mV。Rg1-NPs的包封率為(62.83±2.84)%。4 ℃儲藏條件下人參皂苷Rg1泄露率為 (5.98±0.58)%，在常溫儲藏條件下人參皂苷Rg1泄露率為(13.64±1.84)%。在1、4、12、24、36 h分別檢測人參皂苷Rg1的釋放率，結(jié)果顯示隨著釋放時間的延長，人參皂苷Rg1的釋放率越高，在24 h后釋放保持穩(wěn)定，見表1。

表1 Rg1-NPs體外穩(wěn)定性

2.2Rg1-NPs對BMECs增殖的影響MTT實驗結(jié)果顯示，Rg1-NPs組(0.56±0.03)和Rg1組(0.49±0.02)BMECs細(xì)胞的增殖皆高于對照組(0.44±0.01)，其中Rg1-NPs組BMECs細(xì)胞的增殖高于Rg1組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明Rg1和Rg1-NPs均可促進(jìn)BMECs細(xì)胞增殖，且Rg1-NPs優(yōu)于游離Rg1。

2.3Rg1-NPs對BMECs遷移的影響嵌套小室方法檢測的結(jié)果顯示，Rg1-NPs組(55.33±5.03)和Rg1組(43.67±2.08)遷移的細(xì)胞數(shù)量均高于對照組(35.00±3.00)，其中Rg1-NPs組遷移的細(xì)胞數(shù)量高于Rg1組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明Rg1和Rg1-NPs均可促進(jìn)BMECs細(xì)胞遷移，且Rg1-NPs優(yōu)于游離Rg1。見圖1。

a:對照組; b:Rg1組; c:Rg1-NPs組

2.4Rg1-NPs對BMECs成管的影響小管形成實驗結(jié)果顯示，Rg1-NPs組和Rg1組管腔形成的網(wǎng)眼、點(diǎn)和管腔長度明顯均高于對照組，其中Rg1-NPs組管腔形成的網(wǎng)眼、點(diǎn)和管腔長度高于Rg1組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明Rg1和Rg1-NPs均能促進(jìn)BMECs細(xì)胞的管腔形成，且Rg1-NPs優(yōu)于游離Rg1。見圖2，表2。

a:對照組; b:Rg1組; c:Rg1-NPs組

表2 Rg1和Rg1-NPs對管腔形成的網(wǎng)眼、點(diǎn)和管腔長度的影響

3 討 論

缺血性腦卒中是具有高致殘率、高致死率和高復(fù)發(fā)率的疾病，且隨著全球人口老齡化，其發(fā)病率還在逐年遞增[6]。缺血性腦卒中已成為社會的巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，但目前治療方面只有少量抗血栓藥物，并存在再灌注損傷和出血的安全問題，因此有必要積極探尋一些新的潛在治療藥物。

缺血性腦卒中是由于腦部供血動脈阻塞導(dǎo)致腦組織供血減少，造成相應(yīng)神經(jīng)功能受損。據(jù)報道，腦卒中患者生存期與卒中區(qū)域的微血管密度密切相關(guān)[7]。據(jù)報道腦缺血后的軸突生長往往發(fā)生在血管新生之后，且鮮少出現(xiàn)在缺血部位周圍，說明血管新生與軸突生長密切相關(guān)，血管新生是缺血性腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)的治療關(guān)鍵[8]。血管新生促進(jìn)缺血性腦卒中后神經(jīng)發(fā)生(包裹神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移和分化)主要體現(xiàn)兩個方面：首先，新生血管可以為腦組織提供氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和可溶性因子，為神經(jīng)干細(xì)胞遷移提供良好的微環(huán)境；其次，新生血管分泌的β1整合素可以促使神經(jīng)母細(xì)胞與血管黏附，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞遷移[2]。鑒于缺血灶和其周圍組織的血管新生對神經(jīng)發(fā)生的重要性，血管新生是缺血性腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)的治療關(guān)鍵，而促進(jìn)血管新生的藥物則很可能是改善缺血性腦卒中的潛在治療手段。

人參皂苷Rg1是從三七和人參根莖中提取的主要活性物質(zhì)，能夠通過血管新生來促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、遷移和分化，也可以抑制細(xì)胞毒性誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激來減少神經(jīng)元的凋亡，降低腦缺血動物模型的神經(jīng)功能缺陷評分和腦梗死體積[9-10]。人參皂苷Rg1具備良好地促血管新生和神經(jīng)保護(hù)功能，卻無法靶向作用于BMECs。BMECs是BBB的重要組成部分，保持和恢復(fù)BMECs的正常生物學(xué)功能有利于促進(jìn)血管重塑。近年來有關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物傳遞系統(tǒng)迅速發(fā)展，研究者們逐漸通過增加藥物脂溶性、制備藥物載體以及鞘內(nèi)給藥等方式，穿透或靶向血腦屏障從而增加藥物的生物利用率[11-12]。于是我們制備了耦聯(lián)單克隆抗體OX26的Rg1-NPs，利用單克隆抗體OX26與BMECs中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合，載藥靶向作用于BMECs[5, 13-15]。前期實驗已經(jīng)證實Rg1-NPs能夠主動作用靶組織，進(jìn)而促進(jìn)大鼠腦梗死的恢復(fù)[16]。本研究進(jìn)一步探索了Rg1-NPs改善缺血性腦梗死的調(diào)控機(jī)制，我們通過觀察Rg1-NPs對體外微血管內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)的影響，探究其對缺血性腦卒中后血管新生的作用。結(jié)果表明Rg1-NPs可以促進(jìn)BMECs細(xì)胞的增殖、遷移和成管，且效果優(yōu)于游離Rg1。目前諸多研究發(fā)現(xiàn)中藥有效活性成分在改善缺血性腦卒中后血管新生方面具有一定的功效，但傳統(tǒng)給藥途經(jīng)往往由于胃酸的破壞以及肝的首過效應(yīng)導(dǎo)致生物利用率偏低，運(yùn)用納米材料作為藥物載體的新型給藥方式可以有效提高藥物的生物利用率和吸收速率。本項研究為缺血性腦卒中后的血管新生和神經(jīng)功能恢復(fù)提供了新的治療角度，Rg1-NPs有望成為缺血性腦卒中的一種臨床治療藥物。