迮浩城，陳勇勝，陳 珊，黃 靖，賈晨曦，田大為，李增鳴

空間定向是一種特殊的定向能力，指有機(jī)體在所處環(huán)境中正確辨識(shí)方向的知覺反應(yīng)或能力。哺乳動(dòng)物個(gè)體能正確辨認(rèn)其所處環(huán)境中的當(dāng)前地點(diǎn)、環(huán)境、自己所處位置與周圍環(huán)境的關(guān)系，以及相互間的空間關(guān)系等。前庭功能異常導(dǎo)致空間定向障礙的發(fā)生，在成人前庭核中，谷氨酸能突觸介導(dǎo)興奮性神經(jīng)傳遞，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體不僅調(diào)節(jié)中樞前庭神經(jīng)元的放電特性。對(duì)成人中樞系統(tǒng)的研究表明，這2種電離受體的功能特性高度依賴于它們的亞基組成。含有NR2A亞基的NMDA受體是長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng) (long-term potentiation，LTP)所必需的，而具有NR2B的受體表達(dá)與學(xué)習(xí)記憶和空間定向等功能密切相關(guān)[1-2]。易感基因多態(tài)性的發(fā)掘是前庭系統(tǒng)發(fā)病機(jī)制研究方向之一，參與空間定向、前庭損傷等許多重要的神經(jīng)認(rèn)知過程[1-2]。NR2B含有谷氨酸功能結(jié)合位點(diǎn)，是NMDA受體中最重要的一個(gè)功能亞基[3]，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（小鼠）中樞內(nèi)的NR2B含量為一般小鼠的雙倍，定向能力（尋找水迷宮）明顯增加；與未敲除NR2B小鼠比較，轉(zhuǎn)基因小鼠空間記憶能力下降，學(xué)習(xí)能力受損，提示NR2B基因?qū)τ诰S持哺乳動(dòng)物定向功能至關(guān)重要[4-5]?；蚨鄳B(tài)性，尤其是位于啟動(dòng)子區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）與相關(guān)疾病關(guān)聯(lián)密切[6-7]。已有研究主要就NR2B基因與神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，NR2B基因啟動(dòng)子多態(tài)性位點(diǎn)與多種疾病相關(guān)[8-10]。本研究通過國(guó)外基因數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)NR2B基因SNP進(jìn)行生物信息分析，發(fā)掘其易感性，對(duì)外周系統(tǒng)疾病的防診治提供客觀的預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 人NR2B基因啟動(dòng)子SNP信息 人NR2B基因啟動(dòng)子SNP(+1 bp～-1.5 kb)位置在染色體-12反向序列中網(wǎng)址（http://www.ncbi.nlm.nih.gov /nuccore/，14133022-14134522，NCBI編號(hào): NC_000012.11），在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索SNP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp），發(fā)掘NR2B基因啟動(dòng)子SNP（1.5kb）。搜索選項(xiàng)為來源：人、染色體：12號(hào)、區(qū)間：17215035 to 17217560。人NR2B基因啟動(dòng)子SNP序列同源性采用加州大學(xué)醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway），多態(tài)性位點(diǎn)等位基因頻率（不同人種）檢索Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)分析（http://www.ensembl.0rg/index.html）

1.2 方法

1.2.1 NR 2B基因啟動(dòng)子SNP和臨近序列的同源率 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索設(shè)置人NR2B基因啟動(dòng)子SNP為基準(zhǔn)，檢索其他物種的基因多態(tài)性（堿基一致）。人NR2B基因啟動(dòng)子SNP同源率=等位基因一致的物種數(shù)目之和/物種總量。設(shè)置SNP（各物種）20個(gè)堿基（上下游）為同源對(duì)比序列，分析各個(gè)物種與人類之間基因多態(tài)性位點(diǎn)周圍序列的同源率，其平均值及標(biāo)準(zhǔn)差通過SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。

1.2.2 基因多態(tài)性臨近序列轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件 人NR2B基因啟動(dòng)子SNP臨近序列（上、下游20個(gè)堿基）中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)及元件通過TFSEARCH-on line數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，最低可信值（q）限定0.85。

2 結(jié)果

2.1 NR2B基因啟動(dòng)子SNP及其等位基因頻率（不同人種） 在NR2B基因啟動(dòng)子（+1 bp～－1.5 kb）檢索到11個(gè)SNP，命名為S1-11（如圖1），其中核心啟動(dòng)子區(qū)域有3個(gè)SNP，為S9-11。結(jié)果顯示SNP的信息（SNP序列號(hào)、祖?zhèn)骱托律任换?、在染色體上的位置）（表1）；NCBI上發(fā)布的SNP（不同人種）及其等位基因頻率（Ensembl未提供S1、S-7），其中S2、S9-11對(duì)應(yīng)的等位基因頻率遠(yuǎn)低于單個(gè)等位基因頻率，亞洲人群S2中A等位基因遠(yuǎn)高于C等位基因；歐洲人群S9中G等位基因遠(yuǎn)高于A等位基因；S10中中國(guó)漢族與日本人群（G/A比值）最低，美國(guó)人群其次，尼日利亞種族遠(yuǎn)高于上述人群；S11中美國(guó)人的A/G比值高于亞洲人種，提示NR2B基因啟動(dòng)子SNP等位基因頻率的一個(gè)重要特性，即存在人種差異性（表2）。

圖1 NR2B基因啟動(dòng)子區(qū)域上的多態(tài)性位點(diǎn)分布圖

表1 NR2B基因啟動(dòng)子區(qū)域SNP相關(guān)信息

表2 NR2B基因啟動(dòng)子區(qū)域SNP不同人種等位基因頻率

2.2 NR2B基因啟動(dòng)子序列保守性與多態(tài)性位點(diǎn)之間的關(guān)系 UCSC-on line數(shù)據(jù)庫(kù)中，設(shè)置群體為大鼠、小鼠、狗、母牛和馬，檢索基因?yàn)镹R2B，區(qū)域?yàn)閱?dòng)子區(qū)，分析指標(biāo)為保守性，結(jié)果提示如圖2，目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)序列和基因多態(tài)性位點(diǎn)保守性特點(diǎn)為，SNP（S1～S8）距離核心啟動(dòng)子越遠(yuǎn)，保守性越低；與之相反，SNP（S9～S11）距離核心啟動(dòng)子（+500 bp至+1 bp）越近，基因多態(tài)性位點(diǎn)所在序列的保守性越高（圖2）。

圖2 NR2B基因啟動(dòng)子區(qū)SNPs保守性分析

2.3 NR2B基因啟動(dòng)子SNP臨近序列同源率的對(duì)比分析 圖3（A）提示的是NR2B基因啟動(dòng)子SNP臨近序列分析結(jié)果，對(duì)比序列中所列出的多態(tài)性位點(diǎn)等位堿基，即祖?zhèn)鞯任换颍瑏碓从贓nsembldatabase，其中S1、S3-8、S10共八個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)序列同源性一致；顯示SNP祖?zhèn)鞯任换虻耐绰室哂谛律任换?，這說明祖?zhèn)鞯任换蛟诓溉閯?dòng)物中具有保守性；SNP臨近序列的同源率變化與SNP祖?zhèn)鞯任换虻耐绰首兓３只疽恢拢▓D3B）。

圖3 NR2B基因啟動(dòng)子區(qū)域SNPs及其鄰近序列(F1-F11，上下游共20個(gè)堿基)的同源率比較

2.4 基因多態(tài)性臨近序列上潛在的轉(zhuǎn)錄結(jié)合元件和包含的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn) 采用TFSEARCH-database預(yù)測(cè)了含基因多態(tài)性位點(diǎn)等位基因臨近序列上潛在的轉(zhuǎn)錄結(jié)合元件和包含的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)，數(shù)據(jù)顯示（表3）：含S1-5、S8-11等9個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)不同等位基因所在序列存在轉(zhuǎn)錄結(jié)合元件和包含的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)，而S6不同等位基因臨近序列只能預(yù)測(cè)一個(gè)轉(zhuǎn)錄結(jié)合元件和包含的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)，含S7序列沒有預(yù)測(cè)到轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件。

表3 SNPs上潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及其相結(jié)合的調(diào)控因子

3 討論

NMDA受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的興奮性氨基酸受體之一[11-12]，可調(diào)節(jié)中樞前庭神經(jīng)元的放電特性。NR2B含有谷氨酸功能結(jié)合位點(diǎn)，是NMDA受體中最重要的一個(gè)功能亞基，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（小鼠）中樞內(nèi)的NR2B含量為一般小鼠的雙倍，水迷宮定向能力明顯增加；與未敲除NR2B小鼠比較，轉(zhuǎn)基因小鼠空間記憶能力下降，學(xué)習(xí)能力受損，提示NR2B基因?qū)τ诰S持哺乳動(dòng)物定向功能至關(guān)重。Grassi等[13]發(fā)現(xiàn)NMDA受體不僅調(diào)節(jié)中樞前庭神經(jīng)元的放電特性，而且還與α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor，AMPA）相互作用，誘導(dǎo)前庭神經(jīng)元間的長(zhǎng)期增強(qiáng)。對(duì)成人前腦的研究表明，這兩種電離受體的功能特性高度依賴于亞基的組成。含有NR2A亞基的NMDA受體是LTP所必需的，而具有NR2B的受體是長(zhǎng)期抑郁的。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)含有Ca的AMPA受體。2+滲透亞基（GluR1，GluR3，GluR4）是誘導(dǎo)這2種形式的突觸可塑性所必需的，離子型谷氨酸受體能夠在出生后編碼重力相關(guān)信息，但這些受體亞型在耳石器功能成熟中的具體作用仍有待闡明。

基因多態(tài)性的發(fā)掘是前庭系統(tǒng)發(fā)病機(jī)制的學(xué)說之一，參與空間定向、前庭損傷等許多重要的神經(jīng)認(rèn)知過程。目前運(yùn)動(dòng)病、前庭神經(jīng)炎、良性陣發(fā)性位置性眩暈等前庭系統(tǒng)疾病均與環(huán)境因素與遺傳環(huán)境交互作用引起，而基因多態(tài)性的功能意義對(duì)于改變基因或蛋白的表達(dá)與修飾，從而加大個(gè)體、人群和人種之間的遺傳表性差異性，增加上述復(fù)雜疾病的發(fā)病率關(guān)系密切[6-7]。飛行人員抗暈機(jī)病能力不僅僅應(yīng)關(guān)注于后期的環(huán)境鍛煉（懸梯、滾輪、四柱秋千和多維旋轉(zhuǎn)刺激），而從其發(fā)生的機(jī)制來看，先天的遺傳因素更加決定了這種能力的強(qiáng)弱，因此，早期的功能評(píng)估和易感性篩查更為重要。選擇易感基因啟動(dòng)子區(qū)SNP位點(diǎn)可以從影響轉(zhuǎn)錄結(jié)合原件或改變上述基因序列從而影響基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄入手，本文中選擇的SNPs均位于進(jìn)啟動(dòng)子并且易感基因與前庭系統(tǒng)基因有一定關(guān)聯(lián)性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)S2、S9-11等位基因頻率存在人種差異性，S5位點(diǎn)等位基因頻率無人種差異性[15]；該易感基因啟動(dòng)子區(qū)位點(diǎn)的保守型特點(diǎn)在于距離核心啟動(dòng)子區(qū)的距離與保守程度成正比，這與距離核心啟動(dòng)區(qū)基因多態(tài)性位點(diǎn)與影響基因轉(zhuǎn)錄與翻譯的概率正比的情況一致[16]，即核心啟動(dòng)子的SNPs可能參與靶基因的調(diào)控與表達(dá)，在線分析提示，不同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件位于含S1-5、S8-11等九個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)序列中，一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件位于含S6基因多態(tài)性位點(diǎn)序列，這些差異可能是SNPs影響NR2B表達(dá)的重要原因之一，這些分析將為進(jìn)一步研究NR2B基因啟動(dòng)子區(qū)域SNPs與前庭系統(tǒng)疾病的關(guān)聯(lián)性提供理論基礎(chǔ)。